第一部分:天竺葵素在体外对小鼠软骨细胞炎症和表型的影响及其机制的研究目的:骨关节炎是中老年人常见的疾病,主要临床表现为关节畸形、疼痛和功能障碍,其发病与软骨细胞外基质的破坏和炎症反应息息相关。炎症和炎症反应是引发和加剧骨关节炎发生发展的关键因素,在这些炎症因子中,白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)被认为在骨关节炎的病理发展中起到关键作用。核转录因子κB(NF-κB)是一种二聚体转录因子,起到协调多种生理和病理过程的作用,特别是炎症的发生与发展。天竺葵素(Pelargonidin,PG)属于花青素的一种,是一种天然存在于植物中的化合物,它已被证实在某些疾病中具有抗氧化和抗炎作用。但是,天竺葵素对骨关节炎的作用还未被证明,其具体的作用机制还有待深入研究。本部分旨在探讨天竺葵素对于IL-1β诱导的小鼠软骨细胞炎症反应的作用及其机制。方法:1.C57BL/6J原代软骨细胞的分离、培养及冻存。2.利用细胞计数试剂盒-8(cell counting Kit-8,CCK-8)法检测PG和IL-1β(10ng/ml)对小鼠软骨细胞活性影响。3.利用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测浓度梯度的PG作用于由IL-Nonsense mediated decay1β(10ng/ml)刺激的小鼠软骨细胞后一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)、环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosisi factor-α,TNF-α)基因水平的表达。4.利用软骨细胞高密度培养和甲苯胺蓝染色观察小鼠软骨细胞经IL-1β(10ng/ml)刺激后加入浓度梯度的PG,软骨细胞外基质的形态及染色后的情况。5.利用免疫荧光实验观察浓度梯度的PG作用于由IL-1β(10ng/ml)刺激的小鼠软骨细胞后Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ,COLⅡ)的荧光强度。6.利用免疫印迹试验(Western-blotting,WB)测定浓度梯度的PG作用于由IL-1β(10ng/ml)刺激的小鼠软骨细胞后基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase13,MMP13)、蛋白聚糖酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5)、COLⅡ、i NOS和COX-2在蛋白水平的表达。7.利用免疫印迹试验和免疫荧光实验观察浓度梯度的PG作用于由IL-1β(10ng/ml)刺激的小鼠软骨细胞后p65的核转位情况。结果:1.在0-40μM的浓度范围内天竺葵素对小鼠软骨细胞的活性没有影响,当浓度升高到80μM及更高时,出现了明显的毒性作用。2.在基因层面上单独加入IL-1β(10ng/ml)会促进软骨细胞内炎症介质如IL-6、TNF-α、COX-2、i NOS的表达,而加入PG后IL-6、TNF-α、COX-2、i NOS的表达明显下降,且抑制作用随PG浓度的增加而增强。3.IL-1β(10ng/ml)单独作用于软骨细胞时,甲苯胺蓝染色结果十分浅,随着PG的加入,软骨细胞染色变深,且加深的程度与PG的浓度正相关。4.单独用IL-1β(10ng/ml)处理的软骨细D-Lin-MC3-DMA生产商胞COLⅡ荧光强度很弱,而用天竺葵素和IL-1β共同处理3-MA的实验组COLⅡ荧光强度逐渐增强,并与PG的浓度有关。5.PG在蛋白水平下调由IL-1β(10ng/ml)刺激引起的MMP13、ADAMTS5、i NOS和COX-2的升高,并且抑制IL-1β(10ng/ml)造成的COLⅡ的分解,呈浓度依赖性。6.在IL-1β(10ng/ml)的刺激下,绝大部分p65发生核转位,但是在用PG与IL-1β共同刺激后,p65核转位情况显著减少。结论:PG可以通过抑制NF-κB通路的激活减弱小鼠软骨细胞经IL-1β(10ng/ml)刺激后产生的炎性反应并对软骨细胞表型有维持作用。第二部分:天竺葵素在体内对小鼠骨关节炎模型作用的研究目的:骨关节炎是一种以软骨破坏,软骨下骨增厚,骨赘形成及不同程度的滑膜炎并关节囊增厚为特点的关节疾病,在这部分我们拟采用小鼠内侧半月板-胫骨韧带切除术(Destabilization of the medial meniscus,DMM)构建实验性关节炎模型,在体内水平探究PG对骨关节炎小鼠模型关节退变的保护作用及其机制。方法:1.通过小鼠内侧半月板-胫骨韧带切除术(DMM术)构建实验性骨关节炎模型,口服给药方式给与小鼠PG,8周后处死取膝关节标本制成石蜡切片。2.将石蜡切片进行番红固绿(Safranin O,SO)染色和苏木素伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色。3.利用免疫组织化学染色将石蜡切片进行染色,分析关节软骨细胞Aggrecan、MMP13的阳性表达量。结果:1.经番红固绿染色和苏木素伊红染色可见DMM组的软骨表面较PG实验组更加粗糙不平,严重的地方有软骨面的缺损。给与PG的实验组软骨表面较DMM组有明显的改善,且软骨表面光滑平整程度和PG的浓度呈依赖性。2.经免疫组化染色可见PG实验组较DMM组的软骨细胞中Aggrecan的阳性表达量更多,而MMP13的阳性表达量则更少。结论:PG可以缓解由内侧半月板-胫骨韧带切除术(DMM术)构建实验性骨关节炎模型小鼠的膝关节软骨退变,并维持关节软骨细胞外基质的代谢稳态。