猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度接触性传染性猪呼吸道疾病。该病已在全世界范围内传播,影响所有年龄猪的生长,并对全球养猪产业的经济和生态造成严重威胁。双组份系统(Two-component system,TCS)是大多数细菌的一种重要信号传导系统,能够感知外界环境刺激并作出应答。CpxAR双组份系统是多效应TCSs,目前已知其对APP生物被膜形成、氧化应激、渗透压、热应激和毒力等具有重要影响。本研究发现TCS CpxAR影响APP荚膜的形成和抗冷应激的能力,并展开了以下两方面的分子调控机制研究,以期为致病机制和减毒疫苗的研究提供理论基础。具体研究如下:1.CpxAR双组份系统调控APP荚膜形成的分子机制本研究发现CpxAR双组份系统缺失后,APP荚膜多糖输出系统cpx操纵子(cpx DCBA)的转录水平显著下调。在cpx操纵子的启动子区预测出符合调控因子CpxR结合位点规律的序列。通过凝胶迁移试验(EMSA)证实CpxR蛋白直接与cpx操纵子启动子区发生特异性结合。DNaseⅠ足迹法试验鉴定出CpxR蛋白与cpx操纵子启动子区两段精确的结合位点,位于起始密码子上游92～121 bp和146～170bp处。随后构建了cpxD基因缺失突变株及其互补菌株并通过透射电子显微镜观察到Δcpx AR缺失突变株和Δcpx D缺失突变株的荚膜相较于野生株S4074表现出明显的缺陷。为进一步探究CpxA/CpxR-cpx DCBA通路在APP感染宿主中扮演的角色,测定野生株、缺失突变株(Δcpx AR/Δcpx D)和互补菌株(CΔcpx AR/CΔcpx D)在攻毒后小鼠的存Emricasan IC50活曲线、肺组织和肝组织载菌量,并对攻毒小鼠肺脏进行组织学ethnic medicine观察。动物试验结果表明,cpxAR双组份基因的缺失和cpx D基因的缺失均可导致APP对小鼠毒力显著降低,在小鼠肺和肝脏中定植能力减弱。这些数据表明,CpxAR双组Alisertib化学结构份系统通过直接调控cpx DCBA操纵子的表达增强APP的毒力和定植能力,阐明了CpxAR-cpx DCBA通路对APP感染宿主具有重要意义。2.CpxAR双组份系统调控APP低温条件下生长的分子机制本研究以APP野生株S4074、缺失突变株(ΔcpxAR,ΔcspC,ΔcspD)和互补菌株(CΔcpx AR,CΔcsp C)为研究对象,探究CpxAR双组份系统影响APP在低温条件下生长相关的机制。通过生长曲线试验发现,CpxAR双组份系统的缺失和csp C基因的缺失均可导致APP冷生长速率显著下降,csp D基因缺失不影响其冷生长。在20℃低温环境下,q RT-PCR试验结果发现,cpxA和cpxR基因mRNA表达水平显著上调。LacZ活性检测试验结果显示,低温能够诱导csp C基因高度表达,不能诱导csp D基因表达;并且CpxAR双组份系统影响csp C基因的转录,不影响csp D基因的转录。这些结果表明,cpx A/cpx R/csp C在APP的抗冷应激过程中发挥重要作用,并且CpxAR双组份系统影响csp C m RNA的表达,不影响csp D m RNA的表达。为进一步研究APP冷适应机制,以Δcpx AR为亲本菌株,构建了含有Ptac启动子的csp C/csp D互补菌株。在20℃低温环境下,Δcpx AR/Ptac-csp C生长速率随IPTG诱导浓度的增加而显著提高,而Δcpx AR/Ptac-csp D生长速率无明显变化。这些结果进一步说明低温环境下发挥重要作用的是Csp C而不是Csp D,Csp C是关键冷休克蛋白。通过普通EMSA和点突变EMSA试验阐明了CpxR与csp C基因启动子区结合的序列是位于csp C转录起始位点上游94 bp-110 bp之间。这些试验结果表明,CpxAR双组份系统通过直接正向调控关键冷休克蛋白Csp C的表达来促进APP在低温条件下的生长。综上所述,本课题运用RT-PCR,qPCR,EMSA和DNaseⅠ足迹法等分子生物学和分子生物化学技术,不仅阐明了CpxAR双组分系统通过正向调控荚膜多糖输出系统cpx DCBA操纵子的表达来介导APP荚膜的形成和毒力调节,还证实了CpxAR双组分系统通过正向调控关键冷休克蛋白Csp C的表达来促进APP在低温条件下的生长。本研究为深入探究APP毒力和冷应激调控机制奠定了理论基础,对APP的致病机制和减毒疫苗研究具有重要意义。