目的:本实验以大鼠红细胞为研究对象,利用过氧化氢(Hydrogen peroxide,H_2O_2)及力竭游泳诱导的氧化应激建立大鼠红细胞体内外氧化损伤模型,探究人参总皂苷抵御红细胞氧化应激,增强红细胞能量代谢方面的作用。基于“气血学说”,从人参提高红细胞氧化应激拮抗能力,促进红细胞能量代谢的角度诠释人参“大补元气”的功效作用,探究分子机制并挖掘作用genetic nurturance靶点。方法:1.采用碱提酸沉法提取人参总蛋白,BCA法检测人参总蛋白中的蛋白含量;水提醇沉法提取人参总多糖,苯酚-硫酸法检测人参总多糖中的多糖含量;超声法制备人参总提取物,大孔吸附树脂分离纯化得到人参总皂苷,比色法检测人参总皂苷中的皂苷含量,高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法测定人参总皂苷中各单体皂苷含量。2.利用H_2O_2建立红细胞体外氧化损伤模型,以红细胞溶血率为指标,确定人参优效成分最佳体外给药浓度。3.利用大鼠力竭游泳建立红细胞体内氧化模型,采用H_2O_2诱导筛选出的人参优效成分,检测力竭后给药0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h时,红细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)及三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)水平,筛选出体内最佳给药时间,并基于最佳给药时间,检测人参优效成分给药浓度为10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg时大鼠红细胞中ROS及ATP水平,筛选出人参优效成分最佳体内给药浓度。4.扫描电镜观察红细胞形态;染色法测定网织红细胞数。5.采用流式细胞技术检测红细胞凋亡的水平,并利用比色法测定红细胞中Ca~(2+)含量。6.酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测红细胞中高铁血红蛋白(Met-hemoglobin,Met-Hb)、游离血红蛋白(Free-hemoglobin,F-Hb)、丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutataione,GSH)、促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)的含量,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、己糖激酶(Hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶-1(Phosphofructokinase,PFK)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)的活力,ROS、ATP的水平,及红细胞膜上膜蛋白巯基(Sulphydryl,SH)含量。7.定磷法检测红细胞中Na~+K~+-ATP酶、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶活力。8.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sdium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)法检测红细胞膜蛋白分子量分布,并利用二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)法还原因氧化应激诱导的蛋白氧化交联。9.免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测Band 3蛋白及Band 3蛋白酪氨酸磷酸化(p Tyr)分布和荧光强度。10.免疫印迹印迹法(Western blotting,WB)检测Band 3、Band 4.1、Spectrin、p Tyr蛋白、酪氨酸磷酸化激酶PTK、Syk、酪氨酸磷酸化酶SHP-2、PTP1B表达。11.免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检验Band 3蛋白与糖酵解关键酶HK、PFK、PK及糖化血红蛋白(Hemoglobin A1,HBA1)的互作关系。结果:1.采用碱提酸沉法提取人参总蛋白,收率为2.8%,BCA法测得人参总蛋白中的蛋白含量为86.8%;水提醇沉法提取人参总多糖,收率为5.1%,苯酚-硫酸法测得人参总多糖中的多糖含量为74.25%;超声法制备人参总提取物,再利用大孔吸附树脂分离纯化得到人参总皂苷,收率为3.1%,比色法测得人参总皂苷中的皂获悉更多苷含量为90.2%,HPLC法测定人参总皂苷中各单体皂苷含量为:Rg1(4.50%)、Re(15.22%)、Rf(1.74%)、Rg2(2.69%)、Ro(0.94%)、Rb1(21.51%)、Rc(15.84%)、Rb2(7.17%)、Rb3(3.00%)、Rd(12.62%)。2.H_2O_2诱导的红细胞最佳造模浓度为70 m M,且人参优效成分为人参总皂苷,其最佳体外给药浓度为100μg/m L。3.经过筛选发现,力竭游泳后2 h,且人参总皂苷浓度达20 mg/kg时红细胞ROS及ATP的水平变化最为显著(p<0.001),故选择力竭后给药20 mg/kg的人参总皂苷2 h后进行各实验指标检测。4.扫描电镜的结果显示,H_2O_2及力竭游泳诱导后,红细胞表面发生皱缩,出现大量脊形凸起,给药人参总皂苷后,红细胞的形态逐渐恢复光滑,变为原本的圆盘状;且人参总皂苷的治疗,使氧化应激损伤后的红细胞中的网织红细胞数明显增加。5.通过流式细胞术检测,发现人参总皂苷能显著降低红细胞凋亡水平(p<0.01,p<0.001),同时降低红细胞中Ca~(2+)含量(p<0.05,p<0.01)。6.人参总皂苷能够恢复氧化应激造成的Met-Hb(p<0.05,p<0.01)、F-Hb(p<0.05,p<0.01)、MDA(p<0.05,p<0.01)、EPO(p<0.01,p<0.001)含量增加,ROS(p<0.01,p<0.001)水平的升高及GSH(p<0.001)、膜蛋白SH(p<0.05,p<0.01)含量减少,SOD(p<0.05,p<0.001)、CAT(p<0.01,p<0.001)、HK(p<0.01)、PK(p<0.01,p<0.001)、PFK(p<0.05,p<0.01)活力及ATP(p<0.01,p<0.001)水平的降低。7.人参总皂苷能显著提高氧化应激诱导后红细胞中Na~+K~+-ATP酶、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶活力(p<0.05,p<0.01,p<0.001)。8.利用SDS-PAGE法验证了红细胞膜蛋白分子量分布,且红细胞膜蛋白经DTT还原后氧化交联情况得到改善。9.IF结果显示,人参总皂苷干预后,与模型组相比,红细胞的Band 3蛋白荧光强度明显增强,Band 3蛋白的p Tyr荧光强度明显减弱。10.WB结果显示,人参总皂苷能恢复Band 3、Band 4.1、Spectrin(p<0.05,p<0.01)、p Tyr蛋白(p<0.05)、酪氨酸磷酸化激酶PTK、Syk(p<0.05,p<0.01),酪氨酸磷酸化酶SHP-2、PTP1B(p<0.05,p<0.01)的表达。11.Co-IP结果显示,红细胞氧化应激后Band 3蛋白与糖酵解酶及HBA1的互作关系减弱,进一步降低了红细胞糖GSK2118436配制酵解速率,使红细胞能量代谢受到了影响,人参总皂苷给药后恢复至正常状态。结论:从红细胞溶血率、形态、携氧释氧能力、凋亡及抗氧化能力等变化情况全面证实人参总皂苷对氧化应激诱导红细胞损伤的保护作用。人参总皂苷可能通过保护红细胞膜中的SH免受自由基损伤导致的氧化交联,从而下调Band 3蛋白的p Tyr水平,提高Band 3蛋白表达的同时提升与糖酵解关键酶及HBA1的相互作用,提升红细胞糖酵解能力发挥保护作用。