研究目的:固定对膝关节有一定的影响,可导致膝关节不同程度的挛缩。已有几项研究使用动物模型来检查膝关节屈曲挛缩,但很少有报道建立大鼠膝关节伸直挛缩模型探讨其发病及治疗机制。PTEN对调节胚胎的生长发育,以及细胞生长、分解、凋亡和迁移等方面均具有重要作用,其功能主要是通过控制细胞信号转导通路方式进行生物学功能调节。PI3K/Akt信号转导通路接受PTEN的抑制性调控,PI3K/Akt信号转导通路是调控细胞生长、增殖、存活和凋亡的重要信号通路,它能调节糖原合成medial sphenoid wing meningiomas和葡萄糖转化,与细胞增殖和凋亡减少密切相关。既往研究在中利用膝关节定位的方法建立了膝关节纤维化模型,其结果表明纤维化关节中的成纤维细胞的PTEN基因表达水平降低,从而引起了PTEN基因表达的下降,并由此启动了下游PI3K/AKT的通路,肌成纤维细胞增多,进而促进了关节纤维化的发生。综上所述,PTEN-PI3K/AKT信息与膝关节挛缩有关,其分子机制也可能在膝关节挛缩的发病进程中发挥着重要影响。本研究旨在探讨体外冲击波联合手法牵引对伸直固定所致大鼠关节囊挛缩的干预作用及对PTEN-PI3K/AKT信号通路的影响研究方法:使用本课题组制备的新型铝制膝关节支具(已获国家实用新型专利,专利号:202120470158.0)将大鼠左膝关节伸直位,踝关节跖屈位,固定4周,制作大鼠膝关节挛缩动物模型。36只SD雄性大鼠随机分为6组。对照组(Control group,C group)左膝关节未固定。其他组为了引起关节挛缩,大鼠在左膝关节伸直0°位进行支具固定。制动4周后随机分为5组:模型组(Model, M group)、自然恢复组(Natural recovery group, NR group)、体外冲击波治疗组(Extracorporeal shock wave therapy, ET group)、手法牵引治疗组(Traction Treatment, TT group)、体外冲击波联合长轴牵引治疗组(Combined therapy, CT group)。体外冲击波治疗方法:在膝关节周围的皮肤表面均匀涂抹适量耦合剂,使冲击波治疗探头和皮肤不存在空隙,从而最大限度地减少了冲击波能量的损失,保持了波的稳定传输,冲击部位为膝关节周围(图2)。手法牵引方法:将大鼠放在桌子上,实验人员对大鼠进行了适当强度的人工固定,以保护它们在治疗过程中因过度挣扎而造成伤害。手法牵引作用于大鼠左膝,对关节囊产生牵引作用(图3)。每只大鼠左膝关节接受手法牵引(具体手法包括长轴牵引、屈曲摆动、后前向滑动)。关节活动度测量仪用于评估大鼠左膝关节活动度(ROM);Hematoxylin–eosin (HE)染色和马松染色分别用于评估左膝前方关节囊炎症细胞数和胶原沉积表达程度;免疫组化染色和Western blot实验用于评估左膝前方关节囊磷酸酶和紧张素同源蛋白(PTEN)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的蛋白水平。研究结果:与C组相比,M组的膝关节屈曲ROM显著下降(P<0.05),NR组和M组大鼠膝关节角度无统计学差异(P>0.05)。经过4周的治疗后,与NR组相比,ET、TT、CT组的膝关节屈曲ROM有明显的提高(P>0.05),其中,CT组膝关节ROM明显大于ET组和TT组(P>0.05)。与C组相比,M组左膝关节的关节囊中观察到大量单核细胞和中性粒细胞浸润,细胞数量显著提升(P<0.05);与M组相比,NR组细胞数无统计学差异(P>0.05)。相对于NR组,ET、TT、CT组细胞数量出现了下降(P<0.05)。相对于ET组或TT组,CT组细胞数量下降(P<0.05)。与C组相比,M组Puromycin小鼠胶原组织增生致密,胶原沉积面积明显增多(P<0.05);NR组与M组的胶原沉积面积相比无差异(P>0.05)。经过4周治疗后,相对于NR组,ET、TT、CT组胶原面积百分比出现了下降(P<0.05)。相对于ET组或TT组,CT组胶原沉积百分比下降(P<0.05)。与C组PTEN的光密度值相比,M组的光密度值降低(P<0.05)。NR组与M组的PTEN的光密度值无统计学差异(P>0.05)。相对于NR组,ET、TT、CT组的PTEN光密度值出现了上升(P<0.05),相对于ET组或TT组,CT组PTEN光密度值出现上升(P<0.05);与C组PI3K的光密度值相比,M组的光密度值升高(P<0.05);NR组与M组的PI3K的光密度值无统计学差异(P>0.05)。相对于NR组,ET、TT、CT组的PI3K光密度值下降(P<0.05),相对于ET组或TT组,CT组PI3K光密度值下降(P<0.05);与C组的AKT光密度值相比,M组的光密度值出现升高(P<0.05);NR组与M组的AKT的光密度值无统计学差异(P>0.05)。相对于NR组,ET、TT、CT组的AKT光密度值下降(P<0.05),相对于ET组或3-MA IC50TT组,CT组AKT光密度值下降(P<0.05)。M组大鼠左膝关节囊中PTEN的蛋白水平明显低于C组(P<0.05),NR组与M组的PTEN的蛋白水平无统计学差异(P>0.05)。与NR组比较,ET、TT、CT组的PTEN蛋白水平显著升高(P<0.05);相对于ET组和或TT组,CT组的PTEN蛋白水平上升(P<0.05)。与C组相比,M组大鼠左膝关节囊中PI3K/AKT的蛋白水平升高(P<0.05),NR组与M组的PI3K/AKT的蛋白水平无统计学差异(P>0.05)。ET、TT、CT组的PI3K/AKT蛋白水平低于NR组(P<0.05),相对于ET组或TT组,CT组的PI3K/AKT蛋白水平下降(P<0.05)。研究结论:我们的研究表明,支具外固定制作的膝关节挛缩模型中,关节活动度显著降低,关节囊组织产生炎症和纤维化为主的病理学改变;关节囊PTEN表达水平降低,PI3K/AKT蛋白表达水平升高。体外冲击波和手法牵引单独疗法或联合应用后,膝关节活动范围明显提高,关节囊炎症及纤维化明显改善,PTEN蛋白表达升高,PI3K/AKT蛋白表达降低。