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目的 基于一次Belnacasan化学结构性胃部细胞无创采样器采集胃液标本进行幽门螺杆菌耐药基因检测，指导幽门螺杆菌个体化治疗，探讨此技术的临床应用价值。方法 选取2021年5月至2022年5月北京大selleck学深圳医院收治的根治失败2次或以上的难治性幽门螺杆菌感染患者50例，使用一次性胃部细胞无创采样器采集胃液，通过荧光定量PCR法检测抗生素耐药基因，根据耐药结果给予患者制订基于铋剂四联根除治疗方案，疗程14d，治疗结束至少4周后复查尿素呼气试验，确定幽门螺杆菌是否被成功根除。结果Tubing bioreactors 在50例送检样本中，检测幽门螺杆菌阳性者为43例。43例个体化治疗患者根除成功41例，幽门螺杆菌感染根除率意向性分析为95.35%(95%CI为84.19%～99.43%)，遵循方案分析为97.62%(95%CI为87.43%～99.94%)，均显著优于标准铋剂四联疗法（P <0.001）。结论 基于一次性胃部细胞无创采样器采集胃液标本进行幽门螺杆菌耐药基因检测技术指导的个体化治疗在顽固性幽门螺杆菌感染患者中取得比较理想的临床效果，具有较好的应用价值。

目的 探讨第三代头孢菌素类抗菌药物的临床使用情况。方法 选取2021年9月至2022年1月在广州市南沙区第二人民医院进行诊治的使用头孢菌素类抗菌药物的患者723例作为研究对象，其中使用第一代头孢菌素类抗菌药物患者192例，第二代314例，第三代217例。统计所有患者第一代、第二代及第三代头孢菌素类抗菌药物使用情况和销售金额，分析第三代头孢菌素类抗菌药物临床应用情况，统计不良反应发生情况，调查耐药情况。结果 第一代、第三代头孢菌素类抗菌药物以静脉注射为主，第二代头孢菌素类抗菌药物静脉注射与肌内注射比例相当；第二代头孢菌素类抗菌药物的用药频度、销售金额最高，其次为第三代头孢菌素类抗菌药物；2VP-1617例第三代头孢菌素类抗菌药物中头孢他啶不合理用药7例，头孢曲松钠不合理用药9例，不合理用药率为7.37%；使用第三代头孢菌素类抗菌药物患者中出现不良反应18例，占8.29%，其中消化系统8例（3.69%），过敏反应5例（2.30%），血液系统3例（1.38%），泌尿系统2例（0.9Cobimetinib说明书2%）；临床药敏试验结果表明，革兰阴性杆菌对头孢他啶平均耐药率为33.6bio-inspired propulsion7%，对头孢曲松钠平均耐药率为57.64%。结论 本院对第三代头孢菌素类抗菌药物的应用较为合理，在临床治疗时需充分掌握每种药物的应用方法和药理作用，可降低患者不良反应，为药物的合理应用提供保障。

目的 挖掘药食同源类中药治疗糖尿病足（diabetic foot,DF）的用药规律并探究其潜在分子机制，为开发针对DF的药膳疗法提供指Compound 3导。方法 通过检索中国知网、万方数据库和中国生物医学文献数据库中中药方剂治疗DF的临床文献，将其中药名称规范化后与药食同源类中药名单比较，得到药食同源来源方药集；采用中医传承辅助系统分析其用药规律，根据关联规则和聚类分析确定对DF具有治疗作用的药食同源类核心中药；获取核心中药的活性成分及其治疗DF的作用靶点，进行蛋白质相互作用（protein-protein interaWestern Blottingction,PPI）分析以及基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析；利用分子对接及动力学模拟，评估主要活性成分与其对应靶点的结合能力及结合稳定性。结果 共筛选出药食同源类中药方剂521条，其性温平，味甘苦，入心、脾经，以补虚和清热药为主；进一步分析得到具有强关联性组合药对4个，获得4个治疗DF的药食同源潜在新组方药；筛选出当归、黄芪、金银花、甘草和桃仁为治疗DF的药食同源类核心中药，其作用机制主要涉及高级糖基化终末产物-受体（advanced glycation end products,AGE-RAGE）、缺氧反应因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）等信号通路；核心中药包含的主要活性成分槲皮素和β-谷甾醇分别与治疗DF的关键靶点蛋白基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)及氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)具有较好的结合能力及稳定性。结论 药食同源类中药主Panobinostat分子式要通过调节气血凝滞、筋脉阻塞等病机发挥治疗DF的作用，其关键活性成分可通过作用于DF主要治疗靶点MMP9、PPARγ等，进而调节AGE-RAGE、HIF-1和胰岛素抵抗等信号通路协同治疗DF，“黄芪-金银花-甘草”是极具潜力的DF药膳疗法新组方。

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种血液系统恶性肿瘤,其发病机制主要是由于异常增殖和分化障碍而引起的,为成人中最常见的急性白血病。对于身体状况较好的患者,常规治疗手段为“7+3”方案化疗配合造血干细胞移植;对于无法耐受常规化疗的患者,最近美国食品和药品管理局(the US Food and Drug Administration,FDA)批准的Venetoclax联合去甲基化药物或低剂量阿糖胞苷的低强度治疗正逐渐成为该患者的常规疗法。虽然上述疗法能使大多数患者达到完全缓解,但复发、耐药导致AML患者的寻找更多5年总生存率只有30%左右。因此,迫切需要新型治疗方案以高效低毒的方式来改善当前AML的治疗现状。大约30%的AML患者携带FMS样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3,FLT3)基因突变,其中FLT3近膜结构域中的内部串联重复突变(FLT3-internal tandem duplications,FLT3-ITD)约占25%,而FLT3酪氨酸激酶结构域中的点突变或缺失(FLT3-tyrosine kinase domain,FLT3-TKD)突变约占7-10%。上述突变导致FLT3激酶及其下游PI3K/AKT/m TOR、RAS/RAF/MEK/ERK和JAK2/STAT5等信号通路组成型激活,促进细胞增殖和存活,加速AML的进展,因此,FLT3突变往往预示极差的预后。2018年11月28日,美国食品和药品管理局批准Gilteritinib用于治疗复发或难治性具有FLT3突变的AML成年患者,但是治疗效果有限且容易产生耐药性。因此,急需其他抗白血病药物以增强Gilteritinib的疗效,从而突破治疗瓶颈。CUDC-907是一种PI3K和HDAC的双靶点抑制剂,具有强大的抗肿瘤活性,已在多种肿瘤中开展临床前研究并已进入临床实验。实验室之前研究表明,CUDC-907可以下调FLT3蛋白,这促使我们假设CUDC-907通过下调FLT3增强Gilteritinib的抗AML活性。此外,之前的研究发现ERK的活化与Gilteritinib的耐药性息息相关,而CUDC-907作为HDAC抑制剂恰恰可以使ERK失活,进而可能会克服Gilteritinib的耐药性。由此我们推测,CUDC-907可以通过抑制FLT3及其下游的信号通路,与Gilteritinib协同诱导FLT3突变阳性AML细胞的凋亡,同时减弱AML细胞对Gilteritinib的耐药性。针对以上假说,我们首先验证了CUDC-907对FLT3的下调作用,同时还进一步确认了这种下调作用依赖蛋白酶体途径所介导的蛋白质降解。接下来我们探究了CUDC-907和Gilteritinib联合抗FLT3-ITD AML的活性。研究结果表明,CUDC-907和Gilteritinib联合协同诱导FLT3-ITD AML细胞系和原发性患者样本的细胞凋亡,而在健康人外周血单个核细胞中,CUDC-907和Gilteritinib联合引起的细胞凋亡比例非常低,预示该组合具有良好的安全性。同时我们还发现该组合可以显著性杀伤AML祖细胞,但对正常造血祖细胞影响不明显,进一步证明了该组合出色的肿瘤选择性。最后,在MV4-11构建的异种移植瘤小鼠模型中,该组合Genetic bases耐受性良好,显示出了强大的体内抗AML活性。接下来,我们深入地探究了CUDC-907和Gilteritinib协同抗FLT3-ITD AML的分子机制。研究发现,CUDC-907和Gilteritinib联合可以下调和抑制FLT3激酶,从而抑制其下游的selleckPI3K/AKT/m TOR、RAS/RAF/MEK/ERK和JAK2/STAT5信号通路的活化,同时还可以下调抗凋亡蛋白Mcl-1和癌蛋白c-Myc,上调促凋亡蛋白Bim。Bax和Bak双沉默部分削弱了CUDC-907和gilteritinib诱导的细胞凋亡。此外,我们还发现Gilteritinib导致ERK的活化,CUDC-907导致STAT5的活化,进而产生耐药性,而Gilteritinib和CUDC-907可以相互克服这些耐药机制,增强双方的药效。另外,通过代谢组学分析,我们发现CUDC-907和Gilteritinib联合可下调细胞代谢物的水平并产生持续的抗FLT3-ITD AML作用。综上,本研究确定了CUDC-907和Gilteritinib的联合协同抗FLT3突变阳性AML的活性;二者通过下调和抑制FLT3,抑制MAPK/ERK和JAK2/STAT5途径,从而诱导Bim,下调Mcl-1和c-Myc以及细胞代谢,导致持续性抗AML活性。本研究为CUDC-907和Gilteritinib联合应用治疗FLT3突变阳性AML提供了坚实的理论与实验依据。

目的：观察四逆散合颠倒木金散治疗肝胃气滞证幽门螺杆菌（Hp）感染慢性非萎缩性胃炎（CNAG）的临床疗效。方法：选取肝胃气滞证Hp感染CNAG患者共64例，随机分为对照组和治疗组各3www.selleck.cn/products/pci-327652例。对照组给予铋剂四联疗法治疗，治疗组在对照组的基础上加用四逆散合颠倒木金散治疗。连续治疗2周后，比较2组胃肠道症状分级评分（GSRS）、肝胃气滞证证候评分、Hp根除率及临床疗效。结果：治疗组总有效率为90.63%，对照组为65antibiotic pharmacist.63%,2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗前，2组GSRS评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后，2组GSRS评分均较治疗前显著降低（P<0.05），且治疗组GSRS评分显著低于对照组（P<0.05）。治疗前，2组胃脘痞满、胃脘胀痛、胁肋部胀满、嗳气等证候评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后，2组上述各项肝胃GDC-0973体外气滞证证候评分均较治疗前显著降低（P<0.05），且治疗组各项评分均低于对照组（P<0.05）。治疗组Hp根除率为84.38%，对照组为56.25%，组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：在西医常规治疗的基础上加用四逆散合颠倒木金散治疗肝胃气滞证Hp感染CNAG，能有效改善患者的临床症状，提高Hp根除率及总体临床疗效。

目的：探讨HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路对宫颈癌细胞免疫功能的影响。方法：体外构建HPV16 E7过表达和干扰质粒，转染至SiHa细胞，qPCR检测HPV16 E7 mRNAmiRNA biogenesis表达水平，流式细胞术检测CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。在此基础上分别转染cGAS-siRNA和STING-siRNA至SiHa细胞，CCK8检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋TGF-beta/Smad抑制剂亡。qPCR和Western blot分别检测cGAS、STI确认细节NG、IFN-Ⅰ、HPV16 E7的mRNA及蛋白表达。流式细胞术检测细胞CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。结果：STING-siRNA+HPV16 E7过表达组CD95和MICA/B水平降低（P<0.05）,CD73、CD39、CTLA-4和CD25水平升高（P<0.05）。cGAS、STING和IFN-Ⅰ蛋白表达水平降低（P<0.05）。STINGsiRNA+HPV16 E7干扰组结果与之相反。结论：HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路进而抑制宫颈癌细胞免疫功能。

以蓝莓为代表的浆果在我国资源丰富,分布广泛。花色苷(ACNs)作为浆果中重要的活性成分,不仅能够为果实提供鲜艳的颜色,也具有很强的生理活性功能,如清除自由基、抗炎抗肿瘤、保护视力等,近年来逐渐成为研究热点。然而,花色苷易受p H、温度、添加剂、消化酶等因素的影响而降解,导致其在加工过程中活性损失严重、体内吸收利用率低,制约了Immune contexture花色苷在浆果制品的产业化应用。将花色苷负载在以生物大分子为基础的纳米复合物中可以有效地缓解这些问题。因此本研究通过改性蛋白与多糖构建递送花色苷的复合物提高花色苷在加工、储藏和消化过程中的稳定性,探讨不同多糖对复合物形成和保护作用的影响,利用Zn~(2+)交联形成更稳定的复合物,在细胞和动物模型中评价复合物载体对花色苷细胞抗氧化能力以及体内抗炎能力的增效作用。本文为实现花色苷的加工储藏稳态化和体内活性增效提供了新思路,也为花色苷递送体系的深度研究提供了理论基础。主要结论如下:(1)探究超声预处理联合糖基化改性对蛋白质结构和功能性的影响通过超声预处理联合糖基化对牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白(CA)两种蛋白质进行改性修饰,发现超声预处理(40%振幅,10 min)能分别将BSA和CA的接枝度提高10.57%和6.05%,并且影响了蛋白质的表面疏水性、Zeta电势等理化性质。结构分析显示,超声预处理能够促进蛋白质的解螺旋,暴露出更多结合位点,从而提高蛋白质的接枝程度。与结构相对无序的CA相比,超声和糖基化对结构有序程度更高的BSA的影响更大。此外超声和糖基化处理也改善了蛋白质的水溶性、热稳定性、发泡能力和乳化性能等功能性。(2)探究基于改性酪蛋白的二元BI 10773和三元复合物的构建及对花色苷稳定性影响基于改性的酪蛋白(UGCA),通过自组装形成负载花色苷的二元和三元复合物(ACNs-UGCA、ACNs-UGCA-selleckchem GSK1120212CMC)。适当的超声处理能够促进形成尺寸更小、分布更均匀和包封率更高的复合物。向二元复合物中加入带负电的羧甲基纤维素(CMC),ACNs包封率从27.36%提高至46.74%。ACNs-UGCA-CMC能够通过组分间的疏水作用和氢键等作用力维持较好的胶体稳定性。两种复合物均能有效缓解ACNs在热处理、抗坏血酸和蔗糖共存的环境中的降解,且ACNs-UGCA-CMC的效果更好,使ACNs的损失率分别降低了20.83%、45.96%、18.94%。两种复合物将ACNs在模拟消化过程中的保留率分别提高12.03%和27.11%,并控制ACNs在模拟消化液中的缓慢释放。(3)探究不同多糖对负载花色苷的三元复合物稳态化作用的影响通过分别将羧甲基纤维素(CMC)、海藻酸钠(SA)、κ-卡拉胶(CRG)和硫酸软骨素(CHS)与改性酪蛋白和ACNs复合,制备了4种ACNs-改性蛋白-多糖三元复合物。研究显示,多糖的链长、基团类型和带电量综合影响了复合物的尺寸、包封率以及对花色苷的保护作用。基于SA形成的ComplexⅡ具有最优的包封率(63.27%)和最佳热稳定性,而CHS与改性酪蛋白形成了粒径仅有96.7 nm,且分布更均匀的ComplexⅣ。4种复合物均能提高ACNs对p H、模拟储藏(避光和室内光)、添加剂共存(抗坏血酸、蔗糖和山梨酸钾)条件下的稳定性,且ComplexⅡ的保护效果最佳。在模拟消化过程中,复合物同样保护了花色苷,降低了其在消化介质中的释放量。(4)探究Zn~(2+)交联的复合物对花色苷细胞内抗氧化能力的影响通过Zn~(2+)交联制备出了包封率更高的ACNs-改性酪蛋白-海藻酸钠复合物,当Zn Cl_2/SA的比例为1/10时,包封率最高可达到69.98%。并且在此比例下,复合物将ACNs在PBS及细胞培养液中的保留率分别提高21.71%和24.68%。以20 mmol/L的丙烯酰胺(AA)诱导建立Caco-2和RAW 264.7细胞氧化损伤模型评价ACNs、空白复合载体(CS Carrier)以及负载花色苷的复合物(ACNs-CS)的细胞内抗氧化能力。ACNs和ACNs-CS能够通过提高细胞活力、降低细胞内活性氧水平、抑制细胞早期凋亡而减轻AA造成的细胞损伤;同时也降低了损伤细胞内氧化应激产物MDA含量,并提高相关内源性抗氧化酶T-SOD、CAT、GSH-px活力。ACNs-CS由于在细胞培养环境中具有比ACNs更高的稳定性,从而更有效地缓解AA诱导的细胞损伤。(5)探究花色苷及其复合物对小鼠结肠炎的缓解作用通过3%(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导建立小鼠结肠炎模型,以评估复合物对ACNs体内抗炎作用的影响。口服ACNs-CS有效减轻了造模期间小鼠饮食进水量减少、体重下降,以及便血等情况;显著改善了结肠炎小鼠结肠缩短、脾脏水肿;并缓解了炎症引发的结肠组织结构破坏、睾丸损伤等情况。此外ACNs-CS能够下调小鼠血清中的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌,升高抗炎因子IL-10的分泌水平,并降低小鼠结肠组织中的MPO、NOS的水平,以减轻炎症的浸润;并通过降低小鼠结肠组织中的MDA水平,上调T-AOC、GSH-px水平,来缓解炎症伴随的氧化损伤。另外ACNs-CS也能够提高肠道内优势菌群丰度,从而改善炎症引起的肠道内环境紊乱。

目的：探讨影响幽门螺杆菌(Hp)阳性消化性溃疡患儿Hp根除效果的相关因素。方法：回顾性选取265例福建省龙岩市第二医院儿科收治的Hp阳性消化性溃疡患儿为研究对象，均给予艾司奥美拉唑镁肠溶片、阿莫西林胶囊、克拉霉素缓释片、胶体果胶铋胶囊进行治疗，均持续治疗2 w,观察其Hp根除效果；并根据Hp根除效果将所选患儿分为根除组(185例)和未根除组(80例),比较两组患儿一般资料，并予以多因素Logistic回归分析法分析影响Hp阳性消化性溃疡患儿Hp根除效果的危险因素。结果：265例HBiosensing strategiesp阳性消化性溃疡患儿经治疗后Hp根除成功185例，根除率为69.81%。多因素Logistic回归分析结果显示，有先天性疾病、营养不良、有低蛋白血症、治疗依从性差、克拉霉素耐药、阿莫西林耐药是影响Hp阳性消化性溃疡患儿Hp根除效果的独立危险因素(OR=3.411、3.773、3.404、3.881、3.629、3.357,P<0.05)。PLX3397 molecular weight结论：影响Hp阳性消化性selleck合成溃疡患儿Hp根除效果的危险因素包括有先天性疾病、营养不良、低蛋白血症、治疗依从性差、克拉霉素耐药、阿莫西林耐药等，临床可据此给予患儿有效治疗及干预，以进一步提高Hp根除效果。

目的 比较经口胆道镜引导靶向活检与十二指肠镜下经乳头活检钳活检对胆管狭窄伴可疑胆管癌AY-22989抑制剂的诊断效能。方法 选择2018年4月至2021年4月南阳市中心医院收治的82例胆管狭窄疑似胆管癌患者为研究对象，患者均接受经口胆道镜引导靶向活检及十二指肠镜下经乳头活检钳活检。以术后病灶组织病理学检查结果及至少随访1 a以上诊断结果为最终诊断结果，比较2种活检方法对胆管癌的诊断效能，并评估2种活检方式的安全性。结果 最终诊断结果显示，82例胆管狭窄疑似胆管癌患者中60例确诊为胆管癌；22例确诊为良性胆管狭窄，其中高位胆管狭窄10例，低位胆管狭窄12例。经口胆道镜引导靶向活检诊断为胆管癌53例，最终诊断为胆管癌50例；诊断为胆管狭窄29例，最终诊断为胆管癌10例。十二指肠镜下经乳头活检钳活检诊断为胆管癌42例，最终诊断为胆管癌32例；诊断为胆管狭窄40例，最终诊断为胆管癌28例。经口胆道镜引导靶向活检诊断胆管癌的灵敏度为83.33%,特异度为86.36%,准确度为84.15%,阳性预测值为94.34%,阴性预测值为65.52%;十二指肠镜下经乳头活检钳活检诊断胆管癌的灵敏度为53.33%,特异度为54.55%,准确度为53.66%,阳性预测值为76.19%,阴性预测值为30.00%;十二指肠镜下经乳头活检钳活检诊断胆管癌的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值显著低于经口胆道镜引导靶向活检(χ~2=12.478、5.350、17.786、6.534、8.571,P<0.05)。2种Optimal medical therapy活检方法均可导致患者血C-反应蛋白水平增高，但未导致患者发生胆管穿孔、肠穿孔等并发症及操作相关性死亡。结论 与十二指肠镜下经乳头活检钳活检相比，经口胆道镜引导靶向活检对于胆管狭窄疑似selleckchem E-616452胆管癌患者诊断效能更高，且较为安全。

目的:最新的调查结果显示,目前全球糖尿病总人数已超过5亿,且最主要的以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者居多。中国目前T2DM的发病率已超过全球平均水平,高达11.6%。糖尿病作为一种常见病及多发病,其并发症广泛累及多个器官,从而造成严重的病变。其中累及到肾脏的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是最常见的并发症之一。糖尿病肾病作为一种慢性肾病,其病理特征包括肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化、白细胞浸润等。糖尿病肾病的发病机制复杂多样。到目前为止,对其病因及发病机制的研究仍尚不清楚。支链氨基酸(BCAAs)包括亮氨酸[Leu]、异亮氨酸[Ile]和缬氨酸[Val]。有研究发现支链氨基酸的血液水平与胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病呈正相关。支链氨基酸尤其是亮氨酸长期以来与2型糖尿病的发病相关。亮氨酸除了具有作为合成各类蛋白质的原料这一基本生物学功能外,还能作为信号分子广泛参与细胞内的各种生理或生化代谢过程。据报道,亮氨酸可以通过影响代谢紊乱从而参与糖尿病的发生发展。我们前期的代谢组学发现,在高糖环境下,足细胞中的亮氨酸含量明显增加。由此引发猜想:糖尿病环境下,亮氨酸水平升高是否会引起肾组织损伤,进而影响肾功能,参与糖尿病肾病的发生发展?因此,本研究拟以2型糖尿病小鼠与人肾近端小管上皮细胞(Human Renal Cortex Proximal Tubule Epithelial Cells,HK2)为研究对象,探讨亮氨酸在糖尿病肾病肾组织损伤中的作用,为明确糖尿病肾病的相关病因及发病机制,探索糖尿病肾病的防治方法提供实验依据。方法:1.亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾组织损伤及脂质沉积中的作用8周龄的CD-1小鼠(购自维通利华)20只随机分为两组,正常对照组,采用普通饲料喂养;2型糖尿病组,进行高脂饲料喂养(脂含量60%),8周后腹腔连续注射STZ 50mg/kg的三次,诱导2型糖尿病模型。以空腹血糖浓度连续3次检测超过11.1m M确认糖尿病小鼠模型构建成功。正常对照组小鼠注射等量的溶媒(0.1m M柠檬酸缓冲液,PH值为4.5)。造模成功后,正常组及2型糖尿病组小鼠随机分正常饮水组和亮氨酸组。亮氨酸组以饮水中添加1.5%的亮氨酸喂养。喂养四周后,收集小鼠24h尿,处死动物取血、肾组织。肾组织取材分成三部分,包括石蜡、冰冻以及新鲜组织。1.1亮氨酸对2型糖尿病小鼠生化指标的影响南京建成检测试剂盒检测小鼠24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮的含量。统计学分析。中生北控试剂盒检测血甘油三酯、胆固醇、组织游离脂肪酸的含量。1.2亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小球损伤中的作用过碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain,PAS)观察小鼠肾小球形态学的改变,免疫组织化学技术(immunohistochwww.selleck.cn/products/lee011emistry,IHC)检测肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin的表达,蛋白质印迹(Western blot)检测足细胞标志物nephrin蛋白的表达。1.3亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积以及EMT中的作用。⑴亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积中的作用。油红O染色检测肾组织内脂质沉积情况,免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1的表达,western blot检测脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1蛋白的表达。⑵亮氨酸在2型糖尿病小鼠EMT及巨噬细胞浸润中的作用。免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测EMT相关指标FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin、CD68的表达,蛋白质印迹(Western blot)检测FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白的表达。2.亮氨酸在人肾小管上皮细胞脂代谢及EMT中的作用。将人肾小管上皮细胞(HK2)分为对照组(control)、亮氨酸组(Leu)、高糖组(HG)、高糖加亮氨酸组(HG+Leu)以及高糖去亮氨酸组(HG-Leu)。待细胞融合60%时分别加亮氨酸和高糖刺激,孵育48h后收集细胞。Western blot检测EMT相关指标FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin,脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1蛋白的表达。油红O染色检测不同浓度以及不同时间的亮氨酸刺激下肾小管上皮细胞脂质沉积的情况。3.统计学分析实验结果采用SPSS21.0统计分析软件进行数据处理,正态分布的计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,两组间数据比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon秩和检验,P<0.05具有统计学义。结果:1.亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠肾组织损伤及脂质的沉积1.1亮氨酸加重2型糖尿病小鼠血、尿生化肾功能相关指标24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮,在正常组及2型糖尿病组中加入亮氨酸后均增加(P<0.05),说明亮氨酸加重了蛋白尿及肾功能损伤。血脂相关指标血清甘油三酯、胆固醇和组织游离脂肪酸的含量在加入亮氨酸后均增加(P<0.05),说明亮氨酸会加重血脂升高,进而导致血脂的紊乱。1.2亮氨酸加重正常selleck及2型糖尿病小鼠基质沉积及足细胞损伤⑴PAS染色显示正常对照组肾小球基底膜突出,肾小球血管袢薄而清晰,呈红色。在正常对照组和2型糖尿病组中,加入亮氨酸后肾组织中肾小球系膜区显著增宽,ECStructural systems biologyM沉积明显增加,基底膜(glomerular basement membrane,GBM)增厚。⑵IHC结果显示正常对照组肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin表达位置位于足细胞,表达量丰富。2型糖尿病组肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin表达位置位于足细胞,表达量较少。在正常对照组和2型糖尿病组,加入亮氨酸后肾组织中肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin表达明显降低(P<0.01),Western blot检测结果发现在加入亮氨酸后足细胞标志物nephrin的蛋白表达明显降低(P<0.05)。1.3亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积以及上皮间充质转化。⑴亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积。(1)油红O染色发现:正常小鼠肾组织内几乎无脂滴沉积,亮氨酸组有少量脂滴沉积,2型糖尿病组有多量细小脂滴沉积,2型糖尿病加亮氨酸组有大量较大脂滴弥漫分布。(2)免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测正常对照组脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1无明显表达,2型糖尿病组中表达位置位于肾小管,表达量丰富,在加入亮氨酸后表达进一步增加,Western blot检测脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1蛋白水平在加入亮氨酸后表达增加(P<0.05),与免疫组化结果一致。⑵亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠上皮间充质转化及炎性细胞浸润。(1)免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测结果显示:与正常及2型糖尿病组比,在加入亮氨酸后EMT相关指标FN、α-SMA、Vimentin,巨噬细胞标志物CD68的表达增加(P<0.05),E-Cadherin表达降低(P<0.05)。(2)Western blot检测结果显示:与正常及2型糖尿病组小鼠比,在加入亮氨酸喂养小鼠后EMT相关指标FN、α-SMA、Vimentin的蛋白表达增加(P<0.05),E-Cadherin的蛋白表达降低(P<0.05)。2.亮氨酸加重人近端肾小管上皮细胞脂质沉积及上皮间充质转化。(1)油红O结果显示:在正常组及高糖刺激组加入不同的亮氨酸,发现在不同浓度亮氨酸刺激下,随着浓度的增加,肾小管上皮细胞脂质的含量明显增加(P<0.05)。在高糖的环境下,随着亮氨酸浓度的增加,肾小管上皮细胞脂质含量也是明显增加的。但在高糖条件下去除亮氨酸,脂质的含量明显降低(P<0.05)。与正常组相比,随着时间的延长(12h、24h、48h),亮氨酸组脂质含量明显增加。与高糖组相比,高糖加亮氨酸组随着时间的延长,脂质含量也是明显增加的(P<0.05)。(2)Western的结果显示无论在正常组以及高糖组中,加入亮氨酸FN的表达都是增加的,高糖去除亮氨酸组FN的表达明显降低(P<0.05)。脂代谢相关指标SREBP-1,ADRP的蛋白表达都是增加的,高糖去除亮氨酸组蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论:1.亮氨酸加重糖尿病小鼠肾组织损伤,促进肾小球内基质沉积及足细胞损伤。2.亮氨酸促进肾小管上皮细胞内脂质沉积及上皮间质转分化,参与肾间质纤维化的发生。