大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的珍稀濒危野生动物,其种群健康易受到细菌性疾病的威胁,国内外已有多例大熊猫感染奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌等细菌性疾病死亡的报道。但目前采用的传统细菌分离培养法步骤繁琐、检测周期长,已经无法满足临床疾病早诊断早治疗的需求。基于此,本研究开展了可同时检测大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的多重PCR方法的探讨,并应用于大熊猫临床粪便样本的检测;同时对临床分离鉴定的奇异变形杆菌的毒力因子与耐药性进行了研究。以期更好地对大熊猫奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌感染作出及时可靠的临床诊断;亦为大熊猫源奇异变形杆菌的流行病学防控和临床用药提供理论指导,以丰富大熊猫的生物学资料。1.大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌多重PCR检测方法的建立与应用为快速准确鉴定大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌这三种病原菌,本研究分别针奇异变形杆菌脲酶调节子(ure R)基因、肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白(pho E)基因,和大肠杆菌碱性磷酸酶(Pho A)基因设计引物,通过对退火温度、引物浓度等条件进行优化,成功建立了一套三重PCR检测方法并对其检测结果进行验证。结果显示:本研究所建立的多重PCR检测方法经条件优化后,均扩增出预期大小的目的片段;特异性结果显示,只扩增出目标病原菌的特异性基因,而对其他20种大熊猫源病原菌均未出现扩增,表明该方法特异性良好;奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌的DNA检测下限分别为0.87 ng、0.48 ng、0.2 ng。连续8周,每周进行重复性检测均扩增出对应的目的条带,证明重复性良好;利用建立的多重PCR检测方法对来自成都大熊猫繁育研究基地的100份临床样本进行3种病原菌检测发现,奇异Amperometric biosensor变形杆菌检出率为30%(30/100)、肺炎克雷伯菌检出率为90%(90/100)、大肠杆菌的检出率为100%(100/100);多重PCR与单重PCR和病原分离法的符合率为100%。本研究建立了能快速准确鉴定大熊猫源3种病原菌的检测方法,为大熊猫细菌性疾病的诊断提供了新的检测手段,极大缩短了检测时间,指导大熊猫临床治疗用药。2.大熊猫源奇异变形杆菌毒力因子和耐药性研究本研究对采集自成都大熊猫繁育研究基地的亚成年、成年和老年三个不同年龄组共117只大熊猫的150份粪便样本进行奇异变形杆菌的分离鉴定;采用PCR技术、K-B技术和高通量荧光定量PCR技术对分离鉴定的大熊猫源奇异变形杆菌耐药表型(28种抗生素)、耐药基Fer-1抑制剂因型(53种耐药基因)和8种典型毒力因子进行了检测分析,比较了来自不同年龄和性别大熊猫的奇异变形杆菌分离率、耐药性情况。结果显示:(1)150份大熊猫粪便中共分离鉴定出45株奇异变形杆菌,亚成年、成年和老年组大熊猫粪便源奇异变形杆菌的分离ZD1839率分别为28.13%(9/32)、37.35%(31/83)和14.29%(5/35),不同年龄组之间的菌株分离率差异极显著(P<0.01),不同性别组之间分离率差异显著(P<0.05);(2)45株奇异变形杆菌携带了mrp A(100%)、atf C(97.78%)、zap A(97.78%)、atf A(95.56%)、pmf A(95.56%)、ure C(91.11%)和ucc A(84.44%)共计7种毒力因子,未携带rsb A毒力因子;(3)45株大熊猫源奇异变形杆菌对28种抗菌药物均表现出不同程度耐药,其中,对四环素类抗生素耐药率最高(四环素和多西环素分别为77.78%和62.22%),其次是大环内酯类(阿奇霉素55.56%)和β-内酰胺类(阿莫西林和氨苄西林分别为55.56%和51.11%);分析不同性别和年龄大熊猫对抗生素的耐药性差异发现,雄性大熊猫对卡那霉素和环丙沙星的耐药率分别为50.00%、37.50%,显著高于雌性大熊猫(P<0.05),老年组大熊猫对四环素和多西环素的耐药率显著低于亚成年组和成年组(P<0.05),亚成年组大熊猫对美罗培南的耐药率显著高于成年组和老年组(P<0.05);45株大熊猫源奇异变形杆菌分离株中有24株表现为多重耐药,多重耐药菌株占比高达53.33%(24/45),仅有1株分离菌对所有的抗菌药物不产生耐药性;(4)从45株奇异变形杆菌分离株中共检测到44种耐药基因,携带率排名前十的是tet J(100%)、flo R(93.3%)、sul2(93.33%)、aad A2-01(91.11%)、aac(6')-Ib(aka aac A4)-01(86.67%)、aac(6')-Ib(aka aac A4)-02(86.67%)、dfr A1(86.67%)、aph A1(aka kan R)(82.22%)、bla CTX-M-01(75.56%)、amp C-09(66.67%);成年组大熊猫源奇异变形杆菌的氨基糖苷类aac(6')-Ib(aka aac A4)-02耐药基因携带率极显著高于亚成年组和老年组(P<0.01),老年组大熊猫源奇异变形杆菌的四环素类tet PA耐药基因携带率显著高于亚成年组和成年组(P<0.05);雄性大熊猫源奇异变形杆菌的β-内酰胺酶类bla CTX-M-01和四环素类tet C-01耐药基因携带率显著高于雌性大熊猫(P<0.05)。综上所述,本研究成功建立了大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌多重PCR检测方法,特异性和敏感性良好,具有临床应用推广的价值。此外,分离自圈养大熊猫源的奇异变形杆菌毒力因子携带率均在80%以上,且对临床常见的抗菌药物呈现不同程度耐药、多重耐药现象严重,并以四环素类tet J和酰胺醇类耐药基因flo R检出率最高。