目的:本研究以中国经典名方三黄膏为研究重点,在现代中医学基础理论的指导下,在沿用中国经典古方《医心方》的制备方法的基础上,通过调整三黄膏工艺参数,确定组成成分并构建指纹图谱,阐明三黄膏药效物质;对三黄膏药效及作用机制进行研究,为将其开发成质量稳定、疗效确切的中药复方外用制剂。方法:1.三黄膏制备工艺的优化依据三黄膏传统提取方法,在单因素试验的基础上,以盐酸小檗碱、芦荟大黄素、黄芩苷、黄连碱、黄芩素、大黄酸为指标,再以六种指标性成分含量与权重评分乘积为综合评分,对三黄膏的提取工艺参数进行优化;在此基础上,以最佳工艺下提取的三黄膏为研究对象,评价指标选取外观质地及皮肤刺激性,筛选出三黄膏最佳基质,选取药膏的均匀性与稳定性作为评价指标,优化三黄膏成型性工艺的融化温度与加热时间。2.三黄膏指纹图谱的建立采用高效液相色谱法筛选不同流动相以及相应比例、检测波长等液相条件,利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立三黄膏指纹图谱,并采用主成分分析(PCA)等多元统计分析方法,考察21批三黄膏的质量差异。3.三黄膏药效物质的研究采用高效液相联合高分辨质谱技术对三黄膏的药效物质进行研究,根据mz Cloud等多个数据库进行检索筛选,依据每个成分的色谱保留时间、特征离子、质谱裂解的规律等信息,对三黄膏中的有效成分进行结构解析,阐明三黄膏的药效物质。4.基于网络药理学和分子对接探究三黄膏治疗痔疮的作用机制基于文献研究并结合数据库筛选得到三黄膏靶点及痔疮相关靶点,利用Cytoscape软件和STRING数据库构建中药-活性成分-疾病靶点网络及蛋白质相互作用(PPI)网络;运用Autodock Vina进行核心成分和靶点的分子对接,进一步验证了抗炎活性成分与靶点蛋白的亲和力。选取KM小鼠,建立耳肿胀模型,初步探讨三黄膏抗炎活性;选取SD大鼠,建立大鼠肛门直肠肿胀及溃疡模型,通过检测血管通透性、肛门直肠肿胀度、肛门溃疡面积及大鼠肛门直肠组织中炎症细胞浸润情况,考察三黄膏对大鼠实验性痔疮的治疗作用;采用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、NO、PGE2的水平,并检测大鼠直肠组织中EGF和VEGF的水平;采用免疫组化法对各组大鼠肛门直肠组织中的P物质、TRPV1、CGRP与VEGF进行检测,以探究三黄膏治疗大鼠实验性痔疮的作用机制。结果:1.三黄膏制备工艺的优化单因素试验结合响应面设计实验结果得到三黄膏最佳制备工艺为:浸泡时间12 h,煎炸时间60 min,煎炸温度140℃,药油与基质比例为7:1,融化温度为80℃,加热时间为15 min。按此工艺平行做3批制剂,结果:三次平行试验制得的软膏含量均匀、质量稳定,可用于工业化生产。2.三黄膏指纹图谱的建立通过高效液相法建立了21批三黄膏的指纹图谱,探讨了影响三黄膏质量的主要色谱峰,其中共标定了13个共有峰,指认了6个共有峰,通过标准品对照指认出:2号峰为黄连碱,3号峰为黄芩苷,4号峰为盐酸小檗碱,7号峰为黄芩素,9号峰为芦荟大黄素,10号峰为大黄酸。在此基础上,对21批不同批次三黄膏的HPLC指纹图谱结合化学识别模式分析,将21批三黄膏分为3类:S1～S7;S8～S14;S15～S21;筛选出黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸三种差异性质量标志物,为控制三黄膏的质量提供了实验依据。3.三黄膏药效物质的研究采用液质联用技术对三黄膏的药效物质进行检测与分析,通过对ESI正、负离子模式下的质谱信息及元素组成分析,并通过文献检索共鉴定出706个化学成分,其中相似度大于90%的化合物有41个,包括苯丙酸类、生物碱类、黄酮类成分等。4.基于网络药理学和分子对接探究三黄膏治疗痔疮的作用机制收集到三黄膏治疗痔疮活性成分35个及其潜在靶点50个,主要作用于CGRP、NK-1R、TRPV1和VEGF四个核心靶点而发挥疗效,分子对接结果显示三黄膏的主要抗炎活性成分与四个核心靶点有较好的结合活性。5.三黄膏药效及作用机制研究5.三黄膏治疗痔疮作用的研究在小鼠耳肿胀实验中,MED(三黄膏中剂量)组、HIG(三黄膏高剂量)组与CCC(太宁乳膏)组对小鼠耳廓肿胀起到显著的治疗作用(P<0.01);而LOW(三黄膏低剂量)组与MHO(马应龙麝香痔疮膏)组对小鼠耳廓肿胀起到了一定的治疗作用(P<0.05)。在大鼠肛门溃疡实验中,所有大鼠经治疗后,肛门溃疡面逐渐缩小。经三黄膏、MHO和CCC治疗后,大鼠肛门溃疡部分愈合。在MHO和HIG组中,炎症渗出在第11天完全停止;与模型组相比,MHO组和三黄膏各剂量组对大鼠体重降低均具有明显的改善作用。在大鼠肛门直肠肿胀实验中,随着三黄膏的治疗,大鼠ARC(肛门直肠肿胀度)呈现下降趋势;血管通透性实验结果表明,三黄膏能够通过抑制大鼠肛门直肠组织血管通透性,改善大鼠痔疮期间的水肿状态;HE染色实验结果表明,三黄膏能够通过抑制大鼠肛门直肠组织中的炎症细胞浸润,有效减轻大鼠炎症反应,抑制肛门直肠部位水肿。采用ELISA法检测大鼠血清及组织中的炎症细胞因子发现,三黄膏治疗组可以有效地降低血清中相关炎症因子的分泌;通过检测各组大鼠肛门直肠组织中促进大鼠机体愈合与血管生成相关的细胞因子发现complication: infectious,三黄膏高剂量组可以促进大鼠直肠组织中EGF与VEGF分泌。大鼠免疫组化实验结果显示:通过对大鼠肛selleck门直肠组织中P物质、TRPV1、CGRP与VEGF进行检测,模型组大鼠肛门直肠组织中显示出各种物质有效染色,HIG与MED组仅有少量表Roxadustat价格达,LOW组有一定的抑制作用,但效果不明显。结论:本研究以三黄膏为研究对象,在传统工艺基础上,对三黄膏的制备工艺参数进行了优化;运用HPLC法,建立了三黄膏的指纹图谱;采用液质联用技术对三黄膏的药效物质进行研究;并利用分子对接技术对成分及靶点蛋白的亲和力进行验证;并对三黄膏治疗大鼠实验性痔疮的疗效进行了药效学研究,同时采用ELISA实验、免疫组化实验等现代分子生物学实验对三黄膏治疗大鼠实验性痔疮的作用机制进行研究。