硒(Selenium,Se)作为微量元素家族重要的一员,在调节机体代谢、保护健康系统以及维持动物正常生产中具有举足轻重www.selleck.cn/products/BafilomycinA1的作用。硒具有抗氧化、抗炎症和维持机体内环境稳态的作用,而动物无法直接摄入硒元素,必须利用食物链将植物或饲料中的硒元素转化为动物机体所必须的硒蛋白。作为硒元素在动物体内生物学功能发挥主要形式的硒蛋白,其表PF-6463922采购达情况与动物生长以及禽类制品品质密切相关。硒蛋白K(Selenoprotein K,SELENOK)是硒蛋白家族的一员,在心脏、卵巢、肺脏以及肝脏等多组织中高表达。硒蛋白K位于内质网上,是蛋白质加工合成过程中具有调控作用的重要蛋白。而肝脏作为机体蛋白质合成的主要器官,其功能和肝脏细胞健康状态是否受到硒蛋白K调节及相关调节机制缺少详实的研究报告支撑。本试验选择肉鸡进行试验,将120只1日龄鸡随机分为2组,一组为对照组,饲喂富硒日粮(硒含量为0.278mg/kg),另一组为低硒实验组,饲料为购买自龙江县的低硒日粮(硒含量为0.039mg/kg)。在饲喂至15日、25日和35日时分别在每组各自随机选取20只肉鸡进行安乐死,分别记为15+Se组、15-Se组、25+Se组、25-Se组、35+Se组和35-Se组,采集肝脏组织,根据检测需要进行处理保存。以鸡肝癌细胞(LMH)为研究对象,在建立硒蛋白K敲低模型基础上,分为6组,分别为NC+Se组、NC-Se组、Vehicle+Se组、Vehicle-Se组、si RNA+Se组和si RNA-Se组。应用TUNEL染色、肝功能检测、ROS染色、AO/EB染色、Fluo-5N染色、流式细胞术、实时荧光定量PCR、Western blot、透射电子显微镜等技术,检测鸡肝组织和LMH细胞中硒蛋白K的含量、氧化应激指标和ROS含量、PTEN/PI3K/AKT通路相关基因的表达、Ca~(2+)相关基因表达、内质网应激相关基因的表达以及细胞凋亡和程序性坏死相关基因的表达,以期探索并阐明饲料缺硒条件下硒蛋白K对缺硒性鸡肝细胞凋亡及程序性坏死的作用机制。研究结果如下:(1)本试验观察到鸡出现渗出性素质的临床表现,说明缺硒鸡模型构建成功。对鸡肝脏中硒蛋白K的表达情况进行检测,结果显示低硒组中硒蛋白K表达下降。将si RNA转染进入LMH细胞,通过检测LMH细胞中硒蛋白K的m RNA表达情况,确定LMH硒蛋白K敲低模型构建成功。通过检测血清中ALT、ALP、CHE和AST的含量,说明在硒蛋白K表达下调情况下(p<0.05),肝脏功能受到损伤;(2)利用透射电子显微镜对鸡肝脏细胞形态进行显微结构观察。对鸡肝脏组织进行透射扫描,结果显示35+Se组呈现光滑圆形的细胞核,染色质分布正常,内、外核膜完整,细胞核结构形态完好。35-Se组出现明显的细胞凋亡特征,包括细胞核发生皱缩,核仁变小,染色质凝聚、边缘聚集,细胞内产生大量空泡。镜下观察到35-Se组中的内质网有断裂、肿胀的情况发生,并有脱离内质网的核糖体被检测到。TUNEL染色结果表明,-Se组细胞凋亡发生情况更加明显(p<0.05)。通过AO/EB染色,发现在硒蛋白K敲低的LMH细胞中有细胞凋亡的发生,并通过流式细胞术检测得到验证。细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-12和Cyt-c的在鸡肝脏和LMH细胞中的m RNA和蛋白水平显示,细胞凋亡在缺硒组/硒蛋白K敲除组中发生;(3)通过对鸡肝脏组织氧化应激指标进行检测,结果显示,与+Se组相比,-Se组的鸡肝脏组织中抗氧化酶T-SOD含量、CAT活性和T-AOC含量显著降低,H_2O_2、MDA水平显著升高(p<0.05)。说明缺硒/硒蛋白K敲除会引起鸡肝脏组织的氧化应激,而通过在饲粮中添加微量元素硒/在培养基中添加亚硒酸钠提高硒蛋白K含量则会减轻这种氧化应激的发生;(4)通过对PTEN/PI3K/AKT通路基因进行检测,结果显示,在缺硒组/硒蛋白K敲除组中,PTEN表达量增多,受其抑制的PI3K在m RNA和蛋白水平表达均显著下调,同时,通路下游基因AKT的m RNA和蛋白表达水平显著降低(p<0.05)。上述实验结果说明,硒蛋白K表达降低通过增加鸡肝脏细胞内氧化应激激活PTEN/PI3K/AKT通路;(5)通过Fluo-5N染色法对LMH细胞间游离Ca~(2+)进行染色,发现在硒蛋白K敲低组中有大量Ca~(2+)被异常释放。对鸡肝脏和LMH细hepato-pancreatic biliary surgery胞中钙稳态相关基因SERCA和CAMK-IV的m RNA和蛋白水平进行检测,其表达均显著升高(p<0.05)。上述检测结果表明,硒蛋白K表达下调会引发鸡肝脏细胞内钙离子稳态被破坏并发生钙超载现象;(6)鸡肝脏组织和内质网应激相关基因的检测结果提示,缺硒组/硒蛋白K敲低组中内质网应激的相关基因ATF4、ATF6、el F-2α、GRP78、GRP94、IRE和XBP1的m RNA和蛋白表达均显著升高(p<0.05)。以上检测结果提示,硒蛋白K表达下调会加剧鸡肝脏内的内质网应激发生;(7)通过检测HSP家族HSP60、HSP70和HSP90的m RNA和蛋白表达情况,结果显示缺硒/硒蛋白K敲除组上述基因表达显著升高(p<0.05)。说明在缺硒处理/硒蛋白K敲除的情况下,鸡肝脏对于此种应激做出适应,同时HSP家族表达升高也会帮助鸡肝脏细胞在氧化应激期间和之后恢复生理蛋白构象,同时也是介导细胞保护和组织损伤的应激反应启动的标志。此外,HSP60、HSP70和HSP90的m RNA和蛋白表达呈时间依赖性增加,提示随缺硒处理时间的延长,HSP反应逐渐增强;(8)通过检测鸡肝组织和LMH细胞中Cyclin D、CDK4、Cyclin E和E2F1的m RNA和蛋白的表达,结果显示上述基因表达显著增多(p<0.05);同时,Cyclin A、Cyclin B和CDK1/2的m RNA和蛋白表达显著下调(p<0.05)。结合流式细胞术检测结果显示,在缺硒/硒蛋白K敲除情况下,鸡肝脏细胞发生G1/S期细胞阻滞,加剧鸡肝脏在硒蛋白K表达降低时的损伤。综上,日粮缺硒会导致鸡肝脏内硒蛋白K表达降低,引起鸡肝脏抗氧化能力下降,ROS大量异常蓄积,激活PTEN/PI3K/AKT通路,引起Ca~(2+)异常释放、失衡,引起鸡肝脏细胞内质网应激,提高了HSP家族表达,最终引起鸡肝细胞发生细胞凋亡和程序性坏死。同时,硒蛋白K表达下降通过PTEN/PI3K/AKT通路引起鸡肝脏细胞发生G1/S期阻滞,增加p53表达,加剧鸡肝脏细胞凋亡发生。本研究填补了硒蛋白K调节鸡肝脏发生细胞凋亡机制的空白,明确了硒蛋白K对鸡肝脏生理活性的重要意义,揭示硒蛋白K在缺硒病发生过程中的作用机制,为硒蛋白K功能的深入研究提供理论依据和思路。