肠道菌群与宿主的生长发育、营养代谢和免疫调控等生理过程息息相关。肠道菌群与宿主的动态关系有利于宿主的各项生命活动,但机体也可因肠道菌群的失调而导致疾病的发生。断奶是肉羊养殖的重要环节,饲料的改变以及断奶应激等是影响肉羊肠道菌群的重要因素,菌群的改变或其不稳定的状态,与肉羊肠道疾病密切相关。因此,研究肉羊断奶时期肠道菌群的组成及变化对于肉羊健康的生长发育具有重要意义。1.健康断奶肉羊肠道菌群的组成和发育规律无菌采集45日龄肉羊在断奶后第0、5、10、20、30、45d的粪便样品共12份。样品以宏基因组技术测序分析,结果表明在断奶肉羊肠道微生物中共注释到65个门,98个纲,165个目,258个科,646个属和2598个种,厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是断奶后肉羊肠道微生物中的绝对优势菌群,其相对丰度之和达到84%～91%。在厚壁菌门中,梭菌属(Clostridium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)以及拟杆菌门中拟杆菌属(Bacteroides)和副拟杆菌属(Parabacteroides)等是断奶肉羊肠道中的优势菌属。优势菌群在不同日龄断奶羊肠道组成中呈现动态变化,厚壁菌门在断奶后第0 d(56.30%)、第5d(41.71%)相对丰度明显下降,而后呈现上升趋势,并在断奶第30d(72.90%)相对丰度达到最高;拟杆菌门的变化则与厚壁菌呈现相反趋势,在断奶后第5 d(46.75%)时达到最高,在断奶后30 d(16.49%)相对丰度最低。通过多样本比较分析,断奶后第5d羔羊肠道物种数量显著低于其他日龄,主坐标分析显示断奶后第5 d羔羊肠道微生物组成结构与其他日龄的肠道菌群结构差异较大,提示可能与当日羔羊饲料改变以及断奶应激从而导致肠道菌群出现短暂紊乱有关。2.腹泻断奶肉羊肠道菌群组成与分析无菌采集断奶肉羊腹泻粪便样品共10份,通过宏基因组技术测序分析,结果表明10份样品中共注释到58个门,80个纲,95个目,266个科,599个属和2480个种。在门水平上,厚壁菌门是腹泻断奶肉羊肠道微生物中相对丰度最高的门类,其次是拟杆菌门和变形菌门(Proteobacteria)。不同腹泻肉羊肠道中优势菌属各有不同,分别以大肠埃希属(Escherichia)、拟杆菌属、梭菌属和瘤胃球菌属为主要菌属。除此之外,葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)以及支原体属(Mycoplasma)等致病菌属在腹泻断奶羔羊肠道微生物组成中均占有一定比例。在腹泻肉羊肠道微生物组成中共发现113种致病菌或机会致病菌,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter_pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella_pneumoniae)等致病菌在腹泻断奶羔羊肠道中的相对丰度较高。通过将相似日龄腹泻羊与健康羊肠道微生物组成进行比较分析发现,共存在有5个门,6个科,26个属的差异。其中腹泻羊肠道中,变形菌门的相对丰度显著升高(P<0.05),螺旋体门(Spirochaetes)以及梭杆菌门(Fusobacteria)的相对丰度显著降低(P<0.05);在科水平,肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的相对丰度显著升高(P<0.05),瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、优杆菌科(Eubacteriaceae)、螺旋体科(Spirochaetaceae)的相对丰度显著降低(P<0.05);在属水平,大肠埃希属、螺杆菌属(Helicobacter)、志贺菌属的相对丰度显著升高(P<0.05),而瘤胃球菌属、优杆菌属、密螺旋体属(Treponema)、丁酸弧菌属(Butyricicoccus)、纤维杆菌属(Fibrobacter)的相对丰度显著降低(P<0.05);在种水平,包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)等在内的10种致病菌在腹泻肉羊肠道中的相对丰度均高于健康肉羊,布氏密螺旋体(Treponema bryantii)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)等共10种益生菌在腹泻断奶肉羊肠道中相对丰度明显减少。以上结果表明断奶肉羊肠道中多种致病菌的生长繁殖以及益生菌的减少可能是引起断奶肉羊腹泻的重要原因之一。3.断奶肉羊肠道益生菌的分离鉴定采集断奶后的健康肉羊粪样,利用BHI、YCFA、PYG、M2GSC、MRS,CDC琼脂、EG琼脂等肠道益生菌常用培养基进行细菌的分离培养,共获得株63株肠道益生菌或潜在益生菌。进一步鉴定表明这些细菌分属于7个科9个属的17个种,包括单行拟杆菌(Bacteroides uniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、啮齿拟杆菌(Bacteroides rodentium)、多行拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)、海氏肠球菌(购买BelnacasanEnterococcus hirae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus),利莫西罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)以及瘤胃解蛋白质菌(Proteiniclasticum ruminis)。这将为后续相关益生菌的研究以及益生菌制剂的研发提供丰富的菌种资源。4.断奶肉羊肠道致病菌的分离鉴定采集健康和腹泻的断奶肉羊粪样,通过普通培养方法和选择性培养方法结合细菌16S rDNA测序,共分离鉴定出45株致病菌和条件致病菌,分属于11个科16个属的23个种,分别是鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、卡氏隐球菌(Vagococcus carniphilus)、Vagococcus teuberi、大肠埃希菌(Eschecombined immunodeficiencyrichia coli、法式柠檬酸杆菌(Citrobacter farmer)、Comamonas kerstersii、食酸菌属(Acidovorax.sp)、PUN30119生产商Fundicoccus fermenti、Fundicoccus ignavus、坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)、洛菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、小雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、肠生气单胞菌(Aeromonas enteropelogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfrigens)、模拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、嗜血杆菌(Sanguibacter.sp)、Jeotgalibaca ciconiae、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和福氏志贺菌(Shigella flexneri)。由于金黄色葡萄球菌和志贺氏菌与断奶肉羊的腹泻密切相关,重点对分离到的5株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和3株福氏志贺菌(Shigella flexneri)进行药物敏感性分析。使用K-B纸片法对分离菌株进行药敏试验,结果显示5株金黄色葡萄球菌均对左氧氟沙星、阿米卡星和庆大霉素等敏感,对氨苄西林和哌拉西林耐药,;3株福氏志贺菌对四环素耐药,对左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星以及庆大霉素等敏感。