研究目的:1.利用网络药理学的方法来对左金丸治疗溃疡性结肠炎的潜在的信号通路进行挖掘2.观察左金丸在用2.5%DSS自由饮诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中的疗效3.验证通过网络药理学挖掘的信号通路的相关蛋白在溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中的表达并研究左金丸对其的影响,从缓解炎症及细胞凋亡的角度初步探讨左金丸治疗溃疡性结肠炎的潜在作用机制。研究方法:1.本研究首先在TCMSP数据库以及Swibioorthogonal reactionsss Target Prediction数据库寻找左金丸方中两味药物的靶点,同时利用数据库预测溃疡性结肠炎的疾病靶点。通过韦恩图对药物及疾病的靶点做交集,得到药物在疾病治疗中的潜在靶点,然后用这些靶点做多蛋白互作分析后筛选出左金丸治疗溃疡性结肠炎的核心靶点并用其构建蛋白互作(PPI)网络图。采用GO富集分析及KEGG通路分析以研究药物治疗疾病的相关生物途径及机制,得到排名靠前的生物过程及信号通路。将左金丸活性成分、潜在靶点及富集通路进行可视化分析,完成疾病-通路-靶点-有效成分-药物的可视化网络的构建。2.本次动物实验共选用小鼠90只,随机分为6组,包括了1个空白组和5个实验组(n=15)。实验组的造模方式是配制2.5%浓度DSS溶液以自由饮用的方式造模7天,所有组别从2.5%DSS造模液供给停止后8小时开始采用灌胃的方式给药。其中空白组、模型组均采用0.02ml/g/d的生理盐水灌胃给药、美沙拉嗪组采用300mg/kg/d美沙拉嗪溶液灌胃给药、左金丸低剂量组采用1500mg/kg/d左金丸溶液灌胃给药、左金丸中剂量组采用3000mg/kg/d左金丸溶液灌胃给药、左金丸高剂量组采用4500mg/kg/d左金丸溶液灌胃给药。连续给药的时间是7天,在治疗期间,每天记录各组小鼠的一般情况,包括毛发颜色、精神状态、体重、粪便特征,并通过疾病活动指数(DAI)进行评估。给药结束后,于第8天进行取材,取小鼠完整结肠组织,记录小鼠结肠长度并完成结肠病理切片及染色,观察结肠组织的病理学变化,初步判定左金丸对溃疡性结肠炎小鼠的疗效。3.采用Western-Blot法来检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax这几个关键蛋白的表达量,同时利用ELISA法检测溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中IL-6、IL-10、TNF-α这三个炎症因子的表达量,探讨左金丸通过PI3K/AKT/mTOR信号通路治疗溃疡性结肠炎的机制。研究结果:1.运用网络药理学方法筛选出189个左金丸的药物靶点和3175个溃疡性结肠炎的疾病靶点,将药物与疾病靶点取交集得到103个左金丸治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点,进行多蛋白互作分析后筛选出AKT1、EGFR、ESR1、PTGS2、STAT3、MMP9、PIK3R1等关键的治疗靶点,涉及的主要生物过程集中在对外源性刺激的反应、蛋白质自磷酸化等方面,细胞组分主要包括质膜、细胞质及外泌体等,分子功能主要体现在蛋白激酶活性、ATP结合及氧化还原酶活性等方面,涉及到的通路主要集中在代谢途径、癌症途径及PI3K/AKT/mTOR信号通路。左金丸活性成分、潜在靶点及富集通路进行可视化分析的结果显示发现左金丸中药物有效成分槲皮素、小檗碱、β-谷甾醇、吴茱萸次碱等有效成分,可以通过作用在AKT1、PIK3R1等关键靶点和参与代谢途径、癌症途径、PI3K-Akt等信号通路对溃疡性结肠炎的治疗起效。2.本实验采用2.5%DSS溶液成功制备了小鼠溃疡性结肠炎的模型,造模第3天开始除空白组外的各组小鼠体质量均出现的减轻趋势,随着实验的发展,进入给药阶段后,生理盐水灌胃的模型组小鼠体重下降趋势并未得到缓解,与空白组相比,体重的减轻趋势更加明显(P<0.001);而与模型组体重减轻不同的是,美沙拉嗪组、左金丸中、高剂量组的小鼠体重明显改善(P<0.001);空白组的结肠长度在(10.17±Bemcentinib0.90)cm左右,与空白组相比,模型组小鼠的结肠长度为(5.25±0.96)cm,与空白组相比差异性显著(P<0.001),而与模型组相比,用药组的各个实验小鼠结肠长度的缩短程度均有明显的改善(P<0.001),阳性药物组的结肠长度是(9.62±0.10)cm,左金丸低剂量组的结肠长度大约是(7.07±0.18)cm,左金丸中剂量组的结肠长度为(8.05±0.19)cm左右,左金丸高剂量组小鼠结肠长度约为(9.61±0.11)cm。同时,模型组小鼠的结肠组织的炎症评分与空白组相比明显增加(P<0.001),经过治疗后,用药各组显著减少了UC小鼠的DAI评分(P<0.001)。模型组结肠黏膜在显微镜下有明显PD-0332991溶解度的病理性改变,主要表现为:大面积隐窝及杯状细胞消失,结缔组织增生,以淋巴细胞、巨噬细胞及粒细胞为主的炎症细胞从粘膜层弥漫到粘膜下层,且粘膜下层伴有一定程度的水肿等。经左金丸治疗后,小鼠的结肠黏膜的损伤程度均有显著好转。3.在蛋白表达上,模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、pmTOR/mTOR的比值与空白组比较后显著升高(P<0.001),而Bcl-2/Bax的比值则显著降低(P<0.001)。左金丸高剂量组对前三个蛋白比值的抑制效果最为明显(P<0.001),且也能显著上调Bcl-2/Bax这两个蛋白的比值(P<0.001);而左金丸低剂量组对Bcl-2/Bax的调控中与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。在炎症因子的表达上,模型组小鼠的IL-6表达量与空白组相比显著增高(P<0.001),而左金丸中、高剂量组小鼠结肠组织中的IL-6表达量显著降低(P<0.001),左金丸低剂量组相较于模型组也有所降低(P<0.01);模型组小鼠的IL-10表达量与空白组相比较显著降低(P<0.001),而左金丸中、高剂量显著上调了小鼠结肠组织中的IL-6表达量(P<0.01)。左金丸低剂量组相较于模型组也有所升高(P<0.05);经过DSS诱导后,模型组小鼠TNF-α表达量显著增高(P<0.001),经过高中低剂量左金丸药液分别治疗后,小鼠结肠组织中的TNF-α的表达量均得到明显下调(P<0.001)。研究结论:1.网络药理学研究提示左金丸治疗溃疡性结肠炎具有多靶点、多通路的特点,揭示了左金丸可能通过AKT1、EGFR、ESR1、PIK3R1等关键靶点和参与代谢途径、癌症途径、化学致癌-活性氧、PI3K-Akt信号通路等信号通路来缓解肠道黏膜的炎症反应从而达到治疗效果。2.动物实验的结果提示不同剂量的左金丸溶液治疗溃疡性结肠炎小鼠的效果不一,高剂量的左金丸灌胃溶液治疗效果更加明显。其作用机制可能与减少肠黏膜炎症反应,改善肠黏膜的损伤有关。3.通过对通路蛋白的表达及炎症因子的检测可以得出,高剂量的左金丸溶液治疗疾病的机制主要是通过下调IL-6、TNF-α两个炎性因子的表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、pmTOR/mTOR蛋白比值的表达,增加IL-10的基因表达及Bcl-2/Bax蛋白比例,可以促使PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥出抗肠道上皮细胞的凋亡的作用。