研究背景与目的慢性难愈创面已成为目前主要的医疗和社会负担。糖尿病会增加患者的截肢风险,也会导致创面不愈合或延迟愈合。糖尿病及外周血管病导致创面难以愈合的一个主要原因就是微血管再生的能力降低。各种类型的皮肤创面愈合都需要新生血管,从而将氧气、营养物质等运输到损伤部位。如今,许多技术和新型敷料已经开始用于改善慢性创面中的血管生成,包括基于小分子,生长因子、基因、干细胞等方案的治疗。既往研究表明,成人脂肪来源的干细胞(human adipose tissue-derived stem cellselleckchem Gefitinibs,hADSCs)是一种多能间充质细胞群,主要通过旁分泌细胞因子、外泌体和其他活性化合物发挥生物学作用。此外,ADSCs条件培养基(ADSCs conditional mCL13900试剂edium,ADSCs-CM)中含有ADSCs旁分泌释放的活性分子,如细胞因子——血管内皮生长因子a(vascular endothelial growth factor,VEGFa)等、外泌体、脱氧核糖核酸和核糖核酸等,可以刺激组织愈合并调节免疫。然而,ADSCs-CM旁分泌细胞因子的产量和质量不稳定,限制了其治疗作用。一些研究表明,特定的化学物质可以影响间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分泌活性化合物的水平。我们的研究目标是希望用一种能够刺激hADSCs旁分泌增加的化学物质来预处理hADSCs,使用其分泌上清用于促进创面血管化。二甲双胍(metformin,MET)是一种双胍类药物,是治疗2型糖尿病的常用口服降糖药物。MET可以提高机体对胰岛素的敏感性。因此,MET可能有利于创面愈合。自噬是在饥饿或缺氧条件下降解错误折叠的蛋白质和受损细胞器,维持细胞稳态的细胞保护过程。有研究表明,自噬参与了VEGFa介导的内皮细胞血管生成。然而,hADSCs的自噬是否以及如何影响血管化尚不完全清楚。因此,我们想研究MET是否能通过增加hADSCs的自噬水平来促进血管化。方法本研究采用细胞增殖/毒性实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、细胞周期实验和流式细胞术检测体外MET预处理对hADSCs本身性质的影响。采用细胞划痕试验探究未处理或MET预处理的hADSCs的上清对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)迁移能力的影响,采用小管形成试验探究上述上清对HUVECs成管能力的影响,采用western blot实验探究hADSCs表达血管形成相关蛋白Ⅱ(Angiopoietin Ⅱ,Ang Ⅱ)和VEGFa的水平在MET处理前后有无区别,采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测MET预处理前后hADSCs分泌VEGFa含量的变化,采用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)直接观察hADSCs中的自噬小体,采用自噬囊泡免疫荧光检测实验探索hADSCs中MET处理是否影响自噬囊泡水平的变化、western blot实验检测MET处理前后hADSCs中自噬相关蛋白Beclin-1、微管相关蛋白轻链3 Ⅱ(Microtubule-associated protein light chain 3 Ⅱ,LC3 Ⅱ)和自噬蛋白5(Autophagy protein 5,Atg 5)的水平。为探究hADSCs的自噬水平与其血管生成能力间的关系,采用雷帕bio distribution霉素(Rapamycin)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)提高或抑制hADSCs的自噬水平,再通过小管形成试验探究各种自噬水平下hADSCs上清对HUVECs成管能力的影响,采用western blot实验验证各种自噬水平下的hADSCs表达自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ和Atg 5的水平和表达血管生成相关蛋白AngⅡ和VEGFa的水平是否存在关联,ELISA实验验证各种自噬水平下的hADSCs上清中VEGFa的分泌水平。接着为了验证hADSCs分泌的VEGFa是促HUVECs血管生成的关键因素,使用VEGFa中和抗体,中和了hADSCs释放的VEGFa,再通过小管形成实验使用MET预处理前后hADSCs的上清,以及MET预处理hADSCs上清添加VEGFa中和抗体验证这三组上清对HUVECs血管生成能力的影响。最后,采用基质胶栓子实验检测MET预处理hADSCs的上清是否促进体内的血管生成。结果体外结果显示,低浓度MET对hADSCs增殖无影响。MET上调hADSCs中的血管生成相关蛋白AngⅡ和VEGFa和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ和Atg5的表达。此外MET诱导的hADSCs的自噬与促进hADSCs产生和分泌VEGFa有关。且hADSCs分泌的VEGFa是促进血管化的关键分子。体内实验结果显示,经MET预处理,hADSCs可有效促进血管生成。结论MET预处理可通过自噬通路刺激hADSCs分泌VEGFa来促进体外及体内的血管新生。