三类动物疫病病原伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)可感染多种动物和人,主要引起炎性化脓性反应。三结构域蛋白家族(Tripartite motif,TRIM)是一类参与重要生命过程如肿瘤杀伤、抑制病毒复制和细胞凋亡的E3连接酶家族。TRIM家族成员之一的TRIM21是一种调控免疫反应如抗病毒感染、细胞因子和趋化因子分泌的蛋白。众多研究都强调了TRIM21在抗病毒免疫中的重要性,但对其在抵抗细菌或其他病原体中的作用知之甚少。本实验室前期研究证实TRIM21负调控Cp感染小鼠巨噬细胞诱导的炎症反应,然而其调控机制尚不清楚。因此,本试验首先通过转录组学测序筛选可能参与TRIM21调控Cp感染巨噬细胞致炎过程的信号通路;其次通过将Trim21基因敲除或过表达研究所筛选关键信号通路在TRIM21调控Cp感染巨噬细胞致炎反应中的作用及机制;同时利用Cp磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)编码基因(pld)缺失株感染小鼠巨噬细胞,研究PLD与TRIM21调控Cp感染巨噬细胞致炎作用的关系。主要研究结果如下:1.基于转录组学测序分析TRIM21调控Cp感染巨噬细胞致炎的信号通路以感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为10的Cp ATCC19410感染野生型小鼠(WT)和Trimselleckchem LY-18801121基因敲除(Trim21~(-/-))小virological diagnosis鼠腹腔巨噬细胞,并进行转录组学测序,同时通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)方法对转录组测序结果进行验证。本次测序共筛选出1757个差异表达基因(Differential Genes,DEGs),q PCR检测结果显示所选基因的m RNA表达情况与转录组测序结果的表达趋势一致,表明转录组测序数据准确性高。对DEGs进行KEGG富集分析,发现与未受感染的WT和Trim21~(-/-)小鼠巨噬细胞相比,Cp感染巨噬细胞组后,DEGs可富集到NF-κB、MAPK、Ras和Fox O等信号通路上;而与Cp感染WT小鼠巨噬细胞相比,被感染的Trim21~(-/-)小鼠巨噬细胞DEGs可以在Jak-STAT、Fox O和NF-κB等信号通路上富集,提示这些通路可能与TRIM21调控Cp感染巨噬细胞致炎作用相关。2.TRIM21对Cp感染小鼠巨噬细胞NF-κB和p38 MAPK信号通路关键分子磷酸化水平的调控作用基于转录组学分析筛选的Cp感染致炎通路及本实验室前期的研究基础,进一步对NF-κB和p38 MAPK信号通路进行研究。以MOI=10的Cp感染WT小鼠腹腔巨噬细胞,在不同时间点采用Western blot分别检测NF-κB和p38MAPK信号通路关键分子磷酸化水平。结果显示,与未感染组相比,Cp感染2h后NF-κB信号通路关键分子IκBα和p65的蛋白磷酸化水平升高。此外,p-p38在Cp感染后表达水平也升高。以上结果提示,NF-κB和p38 MAPK信号通路参与巨噬细胞应答该病原感染。为进一步明确TRIM21在该过程中的作用,以Western blot检测Cp感染WT和Trim21~(-/-)小鼠巨噬细胞p65、IκBα、p38及其磷酸化蛋白的表达水平。结果显示,与被感染的WT巨噬细胞相比,Cp感染Trim21~(-/-)巨噬细胞细胞后p-p65、p-IκBα及p-p38表达水平均显著升高。同时将Trim21基因过表达,发现p-p65和p-IκBα的表达水平均显著降低。表明TRIM21可通过降低Cp感染小鼠巨噬细胞IκBα、p65和p38分子的磷酸化水平负调控该病原感染巨噬细胞致炎作用。3.TRIM21对Cp感染小鼠巨噬细胞NF-κB信号通路关键分子泛素化水平的调控作用除了磷酸化,泛素化修饰途径也与NF-κB信号通路激活有关。为研究TRIM21对Cp感染巨噬细胞激活NF-κB通路关键分子泛素化的影响,首先通过Co-IP检测TRIM21能否与p65、IκBα发生相互作用。结果显示,在Cp感染前后,TRIM21均能与p65、IκBα发生相互作用。为明确Cp感染是否会引起NF-κB通路关键分子的泛素化,以Western blot和IP分别检测了Cp感染WT巨噬细胞后总蛋白的泛素化水平及p65、IκBα分别在K48及K63位点的泛素化情况。结果发现,Cp感染巨噬细胞的总蛋白泛素化及IκBα在K48位点的泛素化水平均升高,而IκBα在K63位点的泛素化水平未见明显变化。提示Cp感染会增强细胞总蛋白的泛素化水平,且该病原感染巨噬细胞后IκBα主要在K48位点发生泛素化。为进一步研究TRIM21对Cp感染小鼠巨噬细胞NF-κB信号通路关键分子泛素化的影响,用Cp分别感染TriElexacaftor研究购买m21过表达和Trim21~(-/-)巨噬细胞,检测总蛋白泛素化及IκBα在K48位点的泛素化水平。结果显示,与被感染的WT巨噬细胞相比,Cp感染Trim21~(-/-)巨噬细胞后总蛋白泛素化水平及IκBα在K48位点的泛素化水平均降低;而Cp感染Trim21过表达巨噬细胞后,总蛋白泛素化水平及IκBα在K48位点的泛素化的水平均升高。表明TRIM21对Cp感染小鼠巨噬细胞IκBα在K48位点的泛素化水平起正调控作用。4.磷脂酶D在Cp感染小鼠巨噬细胞NF-κB信号通路激活中的作用用MOI=10的ATCC19410及其pld缺失株(ATCC19410Δpld)感染WT小鼠巨噬细胞,以Western blot检测通路关键蛋白的磷酸化水平,以IP和Western blot检测IκBα在K48位点的泛素化水平及总蛋白泛素化水平。结果发现,是否缺失pld对Cp感染巨噬细胞p65、p-p65、IκBα、p-IκBα的蛋白表达水平无显著性影响,提示PLD不参与NF-κB信号通路激活中的IκBα和p65磷酸化。与未感染的巨噬细胞相比,ATCC19410及ATCC19410Δpld感染巨噬细胞后总蛋白泛素化水平及IκBα在K48位点的泛素化水平均升高;但与野生株感染巨噬细胞相比,pld缺失株感染巨噬细胞后,其总蛋白泛素化水平及IκBα在K48位点的泛素化水平均降低,提示PLD与Cp感染小鼠巨噬细胞促进IκBα泛素化有关。综上,本研究表明TRIM21负调控Cp感染巨噬细胞介导NF-κB通路关键分子IκBα和p65的磷酸化水平,以及p38MAPK通路关键分子p38的磷酸化水平,而对被感染巨噬细胞NF-κB通路关键分子IκBα泛素化起正调控作用。缺失pld不影响Cp感染巨噬细胞介导的IκBα和p65磷酸化,但与该病原感染巨噬细胞促进IκBα泛素化有关。