背景脑炎是脑实质弥漫性或多灶性疾病的统称,是临床常见的中枢神经系统感染(central nervous system infection,CNSI)性疾病。病毒感染则是脑炎的主要病因,占脑炎患者的20%-50%。因病毒感染而死亡的人群在亚非地区每年约55000例患者。同时在全球地区每年有15万-30万的新发患者。诱发脑炎的病毒具有神经侵袭或噬神经的作用,或者通过诱发炎症反应导致神经损伤。目前临床上仍以对症治疗为主,缺乏抗病毒感染药物,因此需要更深入探究病毒性脑炎的致病机理以寻找有效的治疗手段,为防治感染病毒脑炎提供新思路。Tim-3在巨噬细胞等天然免疫细胞均发挥关键调控作用,课题组前期发现Tim-3可通过抑制抗病毒蛋白NF90的泛素化介导免疫耐受,促进病毒的免疫逃逸;同时发现Tim-3同STAT1存在相互作用关系,Tim-3通过抑制其磷酸化及核转位,最终使巨噬细胞向M2型极化;此外Tim-3还能通过MARCH8这一E3泛素连接酶促进巨噬细胞上MHC-I分子的泛素化降解。USP25作为一种泛素特异性蛋白酶,能够通过去泛素化调节多种目标蛋白,参与机体抗病毒感染免疫应答、神经退行性疾病、肿瘤等多种疾病发生发展进程。如在参与机体抗DNA或RNA病毒感染免疫应答反应的进程中,USP25能作为一种正向调控分子参与到免疫相关的多种信号通路来调节机体的先天免疫反应。在前期研究中我们发现Tim-3抑制USP25的表达,并可能存在相互作用,然而具体机制尚未明确。Tim-3是否通过抑制USP25的表达促进病毒的免疫逃逸是非常值得探讨的课题。目的本论文旨在探讨Tim-3抑制USP25表达的机制,以及Tim-3-USP25通路在病毒免疫逃逸中的作用。为新的抗病毒策略提供新思路。方法1.通过实验室保有的HAVCR2(Tim-3)-Flox重组转基因小鼠交配筛选出Flox~(+/+)纯合型小鼠,利用其与Lyz2-Cre重组转基因小鼠(髓系细胞特异性表达Cre酶,可在巨噬细胞敲除相应基因)交配并筛选出Flox~(+/+)Cre~+小鼠。提取小鼠基因组DNA、脑组织m RNA及总蛋白,通过琼脂糖凝胶电泳、PCR、实时荧光定量PCR(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹(WT)等多种方式检验Tim-3敲除效果。2.野生型(Wild type,WT)小鼠和巨噬细胞特异性敲除Tim-3鼠(Tim-3-CKO),使用脑立体定位仪颅内注射的方式建立以VSV脑炎为研究对象的病毒模型。观察记录小鼠发病情况、体重及存活数。通过数据分析找到每组老鼠体重数据和Q-VD-Oph临床试验生存率的拐点,以便后续实验开展。3.同上所述,WT鼠和Tim-3-CKO小鼠分组后,构建稳定的感染模型,以病毒感染后6天作为检测时间点,具体通过RT-PCR的方法检测小鼠各组织内VSV病毒载量;对脑组织进行HE染色,根据病毒载量富集水平和HE染色结果,评价模型建立情况。4.同上所述,WT鼠和Tim-3-CKO小鼠分组后,构建稳定的感染模型,以病毒感染后5d作为检测时间点(即取样前一天)进行行为学检测,用旷场实验的方法评估小鼠运动功能的受损情况。5.在前期网络相关性分析Tim-3抑制USP25的基础上验证体内Tim-3对USP25的影响。并在巨噬细胞RAW264.7和小胶质细胞BV2中进行病毒感染及Tim-3敲低试验后,利用WB和RT-PCR检测细胞内病毒载量以及USP25的蛋白质表达水平和m RNA表达水平。6.在HEK293T细胞中共转染USP25-promoter、STAT1及Tim-3-Flag,通过双荧光素酶报告基因的检测验证STAT1是否能够偶联Tim-3抑制USP25的表达。7.在HEK293T细胞中转染相关质粒的方法培养细胞后用免疫沉淀CO-IP技术收集细胞并用Westren blot分析Tim-3与USP25是否存在相互作用。8.在HEK293T细胞中转染相关质Panobinostat小鼠粒并用CO-IP和Westren blot等技术分析在Tim-3-USP25抗病毒感染通路中是否影响TRAF3蛋白的泛素化进而影响下游分子,并同时寻找去泛素化作用的位点,探究Tim-3抑制USP25表达并调控宿主免疫的分子机制。9.通过RT-PCR的方法检测小鼠颅内干扰素如IFN-α4、IFN-β、IFN-γ等炎症因子的表达水平和体外感染巨噬细胞和小胶质细胞后细胞内炎症因子m RNA的表达水平以明确Tim-3抑制USP25表达的意义。结果1.在VSV病毒性脑炎模型中,巨噬细胞Tim-3特异性敲除小鼠的生存率显著升高、病毒载量显著降低,脑内炎症显著缓解、小鼠的行为认知损伤显著改善;2.在VSV病毒性脑炎模型中,巨噬细胞Tim-3特异性敲除小鼠体内抗病毒蛋白USP25的表达显著升高,病毒载量与野生型小鼠相比显著下调,病理结果显示巨噬细胞特异性敲除Tim-3小鼠脑组织损伤程度显著减轻;3体外VSV病毒性脑炎感染模型中敲低Tim-3基因的巨噬细胞和小胶质细胞USP25的表达也显著升高此时细胞内病毒载量同样显著降低;4.Tim-3与USP25存在相互作用;5.在转录水平上STAT1可作为转录因子参与USP25的调节,Tim-3可能通过STAT1抑制USP25的转录进而抑制后续USP25的功能活性;6.在病毒感染条件下,高表达的Tim-3通过抑制USP25表达促进抗病毒关键蛋白TRAF3的泛素化降解,减少体内外炎症因子的表达,进而促进病毒的免疫逃逸。总结本研究主要以免疫检查点分子Tim-3和去泛素特异性酶USP25为主要研究对象,在体内水平上通过建立稳定的matrix biology巨噬细胞Tim-3特异性敲除模式小鼠VSV病毒脑炎模型,探究Tim3与去泛素化酶USP25的关系,实验结果显示,Tim-3对USP25表达有抑制作用,且巨噬细胞特异性敲除Tim-3对病毒性脑炎小鼠有保护作用;在体外水平上敲低Tim-3后巨噬细胞和小胶质细胞中USP25含量升高;Tim-3通过STAT1抑制USP25的转录进而影响下游抗病毒关键蛋白TRAF3泛素化降解过程,减少炎症因子的表达、最终促进病毒的免疫逃逸。本课题研究发现Tim-3调控免疫耐受,促进病毒免疫逃逸的一种新机制,同时也是深入探讨USP25在病毒感染中的表达调节机制,并从中寻求基于USP25的特异性干预策略对于克服病毒感染耐受、开发新的抗感染免疫治疗手段。