【背景】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第二大肿瘤致死因素。肝癌治疗失败的最常见原因是转移和复发。既往研究表明细胞迁移、细胞外基质重塑和血管生成等几个关键生物学过程在肝癌转移中发挥重要作用,然而激活这些过程的分子selleck Enasidenib机制尚不完全清楚。肌动蛋白聚合物(F-actin)是构成细胞骨架动态网络的重要组分并在肿瘤细胞侵袭和转移表型中发挥着重要作用。细胞核中的肌动蛋白保持动态的聚合解离反应,以响应血清刺激、DNA损伤和病毒感染等多种刺激。然而,核内肌动蛋白组装在肝癌细胞转移过程是否发挥重要作用仍然未知。线粒体是产生大量ATP、代谢产物和活性氧的细胞器。这些功能决定了其在肿瘤进展(包括转移)中的关键作用。线粒体三羧酸循环中的代谢产物参与控制蛋白质的翻译后修饰,染色质修饰和DNA甲基化等生理过程。这些翻译后修饰调控蛋白的活性、定位以及互作关系,分析蛋白质及其翻译后修饰对于生理特征及病理发生发展的研究尤为重要。线粒体转录因子A(Mitochondrial Transcription Factor A,TFAM)在线粒体的生物发生和TCA循环的调节中起着关键作用。为深入探究线粒体异常代谢功能对肝癌转移的影响,我们前期构建肝脏特异性TFAM敲biolubrication system除小鼠,在正常饲养过程中短期内并不会导致小鼠肝癌自发形成,但是当我们使用DEN/CCl_4联用方法诱导小鼠肝癌发生时,意外发现TFAM缺失能够稳定地诱导小鼠肝癌发生时出现肺转移,且肺转移结节数目及肺转移发生率均与TFAM表达水平有关。观察细胞骨架时,在TFAM敲低的肝癌细胞中观察到核F-actin的意外组装。目前,TFAM在肝癌转移中的具体作用及其对核F-actin组装的具体作用机制尚不清楚。【目的】1.探究TFAM缺失介导核F-actin组装促进肝癌转移的具体作用。2.探究TFAM缺失介导线粒体代谢异常对核F-actin组装的作用机制。3.明确TFAM缺失介导核F-actin组装在肝癌中的表达情况及其对肝癌患者预后的影响。【方法】1.在肝特异性敲除TFAM基因的C57BL/6J小鼠,利用DEN/CCl_4联用方法诱导小鼠自发肝癌模型,分析肝特异性敲除TFAM对小鼠肝癌发生及转移的具体影响。2.利用鬼笔环肽及Life Act活细胞染色,分析TFAM对HCC细胞核F-actin组装的具体作用,且干预核F-actin组装后进一步探究其对HCC细胞体内外转移的作用。3.ATAC-seq与RNA-seq联合分析下调TFAM后调控HCC细胞转移的特定信号通路及其相关的差异基因。4.Western blot实验检测HCC细胞全细胞裂解液、胞浆及核组分中肌动蛋白变化,进一步探究TFAM对HCC细胞肌动蛋白结合蛋白的具体影响。5.靶向代谢组学分析TFAM敲低的HCC细胞线粒体及胞浆组分中代谢物变化,并分析代谢物对核F-actin组装的具体作用机制。6.利用IHC实验,对TFAM表达及核F-actin阳性率进行检测,并结合肝癌患者临床信息分析其对肝癌患者预后的影响。【结果】1.采用DEN/CCl_4联用方法诱导小鼠自发肝癌模型时,肝特异性敲除TFAM的C57BL/6J小鼠出现自发肺转移且肺转移结节数及发生率与TFAM存在负相关性。2.TFAM下调能够显著促进肝癌细胞核F-actin组装,且使用R62D-actin-NLS突变体抑制核肌动蛋白聚合后能够显著抑制HCC细胞核F-actin的组装,并进一步抑制了TFAM下调所导致肝癌细胞转移作用。3.肝癌细胞中敲低TFAM后总体染色质可及性显著增加,并富集在细胞转移及血管重生成等通路,ELISA、q RT-PCR及Western blot实验进一步验证肝癌细胞中TFAM下调后FN1、ITGB3、IL-6及TGF-β等转移基因的转录增加,且能促进M点击此处MP2的分泌及内皮血管生成,在转入R62D-actin-NLS突变体后显著降低HCC细胞中转移基因的转录。4.HCC细胞中敲低TFAM后显著促进肌动蛋白结合蛋白m Dia2的核转位,抑制m Dia2表达显著抑制了TFAM导致的HCC细胞转移作用,且在肝癌组织样本中核m Dia2阳性率与TFAM表达显著负相关,但与核F-actin阳性率显著正相关。5.靶向代谢组学结果显示TFAM敲低的HCC细胞三羧酸循环阻滞,线粒体中柠檬酸水平升高,Acetyl-Co A、OAA和Malate的水平显著降低,同时在胞浆中Citrate、Acetyl-Co A及其衍生物丙二酰Co A水平显著增加,导致m Dia2丙二酰化并发生核转位,抑制m Dia2丙二酰化显著抑制其核转位同时抑制肝癌细胞的体内外转移。6.肝癌组织中TFAM表达显著下调,且TFAM表达水平与FN1、IL-6、TGF-β和ITGB3四种转移基因的水平显著负相关。核F-actin阳性率与肝癌患者不良预后显著相关。【结论】1.TFAM缺失诱导核F-actin组装进而促进肝癌细胞体内外转移。2.TFAM缺失诱导m Dia2丙二酰化促进其核转位进而诱发核F-actin组装。3.核F-actin增加了染色质可及性,通过调控转移相关基因FN1、IL-6、TGF-β和ITGB3表达促进肝癌转移发生。4.TFAM下调促进肝癌组织核F-actin组装,并与HCC患者的不良预后显著相关。