目的研究证实在过早死亡的原因中,慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)位于第三,仅次于艾滋病和糖尿病,并且由于糖尿病、高血压、老龄化和环境毒素等因素,CKD的发病率仍持续增加,给社会带来了日益严重的问题。肾小球硬化和肾小管纤维化是CKD的核心表现,是大多数慢性和进展性肾病走向终末期肾病的共同命运,其中肾小管上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肾脏纤维化中发挥着重要的作用,特别是肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF),是所有进展性CKD的必然结果。TIF是进行性肾病的统一特征并且最能预测肾衰竭的指标,并且无论基础疾病如何,患者的生存期与TIF有关,并且在所有病因的CKD肾活检中的TIF程度被认为是CKD治疗的预后指标。遗憾的是到目前为止,还没有特定的疗法来阻止肾脏纤维化的进展。此外,介导纤维化的细胞和分子机制仍不甚明了,迫切需要更好地了解肾脏纤维化的复杂机制和相关的细胞介质,以开发新的治疗方法来预防慢性肾脏疾病。炎症在各种CKD活检标本和动物模型中被广泛观察到并被认为是启动肾脏纤维化的关键。多种炎症信号通路参与Pevonedistat分子量TIF中,其中IL-1R/TLR-NF-κB(interleukin-1receptor,IL-1R;toll-like receptor,TLR;nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路就发挥着重要作用,因此如能有效调控该通路的活化可延缓肾脏纤维化的发展,阻止肾功能恶化。单免疫球蛋白IL-1R相关蛋白(single immunoglobulin IL-1R associated protein,SIGIRR),也被称为Toll/IL-1R 8(toll-like receptor/interleukin-1 receptor 8,TIR8)是IL-1R/Toll超家族的特殊成员,已被确定为该信号通路的负调控因子。然而,在IL-1R/TLR-NF-κB信号通路中SIGIRR是否可通过改善信号通路活化,延缓EMT发生未能阐明,且何种机制能调控SIGIRR表达有效减缓IL-1R/TLR-NF-κB的激活目前知之甚少。所以,本研究探讨SIGIRR在调控IL-1R/TLR-NF-κB通路介导的肾小管上皮细胞转分化中作用及调控机制和SIGIRR自身的表达调控,为寻找TIF的治疗延缓CKD进展提供理论依据。方法1、细胞实验:1)探讨人肾小管上皮细胞(human kidney tubular epithelial cells,HKC)细胞内SIGIRR对白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的NF-κB活化是否有负调控作用。构建稳定干涉SIGIRR的HKC细胞(HKC/shSIGIRR)和对照细胞(HKC/shSc),构建稳定过表达SIGIRR的HKC细胞(HKC/SIGIRR)及对照细胞(HKC/Control),检测HKC细胞中SIGIRR的表达变化对NF-κB活化的影响。2)研究活化的NF-κB(p-p65)是否可调控SIGIRR的表达,NF-κB活化抑制剂BAY 11-7082处理HKC细胞,构建稳定干涉p65的HKC细胞(HKC/shp65)和对照细胞(HKC/shSc),cognitive fusion targeted biopsy通过蛋白印记实验(western blot,WB)、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和免疫荧光等检测SIGIRR,NF-κB(p65)及活化的NF-κB(p-p65)的变化。3)研究活化的NF-κB是否可直接调控SIGIRR表达,构建SIGIRR启动子区荧光素酶报告基因载体和突变载体,使用荧光素酶报告基因实验验证活化的NF-κB(p-p65)可调控SIGIRR表达,并进一步通过染色质免疫共沉淀实验,验证活化的NF-κB(p-p65)可结合在SIGIRR启动子区并调控其表达。4)研究SIGIRR在EMT发生中的作用,利用IL-1β激活HKC/shSc和HKC/shSIGIRR细胞、HKC/SIGIRR和HKC/HKC/Control细胞中的IL-1R/TLR-NF-κB通路,光学显微镜记录各组细胞形态变化,划痕实验以及Transwell实验探究SIGIRR对细胞迁移能力的影响,WB、免疫荧光和或q RT-PCR检测E-cadherin,Vimentin,Slug,Twist1,Snail1和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)变化。2、动物实验:1)验证肾间质纤维化是否涉及SIGIRR和NF-κB反馈调控机制,以及该机制是否与EMT发生有关,建立单侧输尿管结扎术(unilateral ureteric obstruction,UUO)SD大鼠模型,检测各组大鼠尿蛋白、血尿肌酐和尿素氮,HE和Masson染色检测大鼠肾脏病理损伤程度和肾间质纤维化程度。2)免疫组织化学法检测UUO组和对照组肾脏组织中IL-1β、SIGIRR、p-p65、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin表达情况。3)UUO组和对照组肾脏组织基因测序分析IL-1β-IL-1R/TLR-NF-κB-TGF-β通路中相关传递蛋白基因表达情况。结果1、HKC细胞内,使用IL-1β诱导激活IL-1R/GSI-IX细胞培养TLR-NF-κB,WB显示在不同时间段细胞内的SIGIRR表达成上升趋势,p-p65表达相比较p65成上抛物线变化,最高点15min时,12 h后恢复原始表达水平。2、HKC/SIGIRR和HKC/Control细胞,暴露于IL-1β后,WB分析显示HKC/SIGIRR细胞的p-p65水平减少。WB分析显示IL-1β处理下,HKC/shSIGIRR细胞对比HKC/shSc细胞中的p-p65水平在15 min内急剧增加。3、HKC/shp65细胞暴露在IL-1β下,15 m和24 h,p65敲低组WB提示SIGIRR表达下调。免疫荧光检测暴露在抑制剂(BAY-117082)24 h的HKC细胞和HKC/shp65细胞与对照细胞比较SIGIRR表达下调。4、荧光素酶重组载体p GL3-Luc-SIGIRR或突变载体转染的293T,荧光分析对比非突变组,PBR1突变后荧光素酶活性下降,PBR2下降比PBR1明显,PBR2和PBR1同时突变组降低更明显。转入p GL3-Luc-SIGIRR的293T细胞经BAY11-7082处理或转入GV248-GFP-Puro-shp65后检测显示活性均下降。HKC细胞经BAY11-7082处理或稳定敲低p65后,q RT-PCR分析染色质免疫共沉淀结果显示:NF-κB(p-p65)结合到PBR2的量大于PBR1。5、HKC/shSIGIRR和HKC/shSc细胞中SIGIRR可改善IL-lβ激活的IL-1R/TLR-NF-κB通路后细胞形态学改变,WB或免疫荧光分析显示E-cadherin下降,Vimentin上升。q RT-PCR显示E-cadherin的表达在24 h和48 h内下降,Slug和Twist 1表达上调,Snail 1的表达没有明显变化。6、Transwell迁移试验显示HKC/shSIGIRR与HKC/shSc细胞相比,暴露于IL-1β48 h后,侵袭能力明显增加。划痕试验显示处于IL-1β诱导下12 h、24 h和48 h,进入划痕的HKC/shSIGIRR细胞数量有所增加。在HKC/SIGIRR和HKC/Control细胞的Transwell和划痕实验中得到的结果正好相反。7、WB显示HKC/shSIGIRR和HKC/shSc细胞中IL-1β激活IL-1R/TLR-NF-κB后24 h和72 h的TGF-β1的水平明显增加。8、UUO模型实验,肾功能分析显示假手术组和UUO组之间的24 h尿蛋白或血清肌酐没有明显改变,UUO组的血清尿素和尿肌酐以及尿素氮的水平相对于假手术组明显增加。UUO组的肾组织中观察到肾小管扩张、上皮细胞坏死、出血和炎症细胞浸润等形式的肾脏损伤,胶原蛋白沉积。9、免疫组化分析提示UUO组肾组织中IL-1β和p-p65高表达,SIGIRR低表达,而对照组和假手术组IL-1β和p-p65表达微弱,UUO肾脏组织切片中的肾小管上皮细胞的TGF-β1水平升高,E-cadherin水平下降,Vimentin水平上升。10、基因芯片分析UUO模型中IL-1β-IL-1R/TLR-NF-κB-TGF-β通路部分蛋白基因表达明显存在异常:IL-1β表达上调,IL-R/TIR受体家族部分蛋白基因(TLR2,TLR4)表达上调,TLR12(人不表达)表达下降。NF-κB家族成员蛋白基因(p52和Relb)表达上调,NF-κB激活蛋白基因(Relt,IRAK3,IRAK4和TRAF1)表达增加,转录生长因子基因(TGF-β1,TGF-β2和TGF-β3)表达增多,EMT相关标志性蛋白基因(Vimentin,Snai1和Twist2)表达同样上调。结论1、肾小管上皮细胞内SIGIRR对IL-1β激活的IL-1R/TLR-NF-κB通路有负调节作用,活化的NF-κB可在基因和蛋白水平上调控SIGIRR表达。2、IL-1β-IL-1R/TLR-NF-κB-TGF-β1通路激活后可促使肾小管上皮细胞转分化的发生,SIGIRR调控该通路活化并抑制转分化。3、SIGIRR可作为肾小管间质纤维化的治疗潜在靶点。