SARS-CoV-2引起的新冠肺炎在全球的迅速蔓延,对全球公众健康构成前所未有的威胁。疫苗是抗击新冠肺炎最有效的公共卫生工具之一,在已被批准用于预防新冠肺炎感染的候选疫苗中,灭活疫苗在抗原结构的完整性和免疫原种类的多样性方面具有独特优势。临床试验表明,目前批准的灭活疫苗可以预防95%以上的重症感染,但灭活疫苗如何刺激免疫系统以引发保护性免疫反应,特别是在组织中如何发挥作用尚不清楚。另一方面,当前对各类候选疫苗的免疫原性评价多集中在疫苗诱导的适应性免疫方面;在重症患者血清中检测到高滴度中和抗体(Neutralizing antbody,nAbs),以及缺乏nAbs或B细胞的患者也可以从SARS-CoV-2感染中恢复提示除了中和抗体外,还有其他因素也介导了免疫保护作用。此外,目前对疫苗或感染引发的先天免疫反应知之甚少,已有研究大多集中在外周PBMC样本并且缺乏疫苗免疫后的人体病毒挑战实验。单细胞RNA测序(Single cell RNA sequencing,scRNA-seq)是研究多细胞行为的有力工具,能够全面描述驱动疫苗和感染的先天和获得性免疫的细胞和分子网络。人类在研究和分析局部组织部位以及病毒挑战实验方面的局限性可以使用动物模型来克服,恒河猴是一种常用于研究和评价呼吸道病毒疫苗和治疗方法安全性和有效性的理想动物模型。因此,为了更全面地表征灭活疫苗引发的外周循环和肺组织中的关键细胞介导的免疫保护反应,我们以恒河猴为研究对象,首先采用传统的免疫原性评价方法对接种了灭活疫苗的恒河猴进行了有效性评价;在此基础上,采用单细胞转录组技术,对恒河猴PBMC和肺组织中的免疫和组织细胞进行了全面的分析以了解灭活疫苗应对SARS-CoV-2感染早期的天然或适应性免疫学特征;最后通过结合体外功能验证试验,我们详细解析了灭活疫苗诱导的NK细胞动员和免疫分子特征。我们首先采用了传统的免疫原性评价方法对SARS-CoV-2灭活疫苗在恒河猴身上的保护作用进行了评估。结果表明,第一针疫苗免疫后14天各动物能产生中和抗体;经过第二针免疫后抗体滴度增加至1:64以上并且攻毒后未见明显下降。其次,我们对攻毒后试验动物的咽拭子、鼻拭子、肛拭子及血液样本的SARS-CoV-2基因组拷贝数进行了检测和分析。结果显示疫苗组的咽拭子、鼻拭子、肛拭子的病毒载量低于对照组,并在感染早期就下降到了病毒检测下限。此外,我们对病毒攻击后5天和7天动物的肺组织进行了病理分析,结果显示疫苗组的肺组织有轻微的非特异性炎症反应,这些轻微的组织学变化在第7天逐渐恢复。然而,对照组恒河猴的肺组织表现出更严重的炎症反应,并持续7天未见恢复迹象。在第二部分scRNA-seq实验中,经过测序和分析流程,我们确定了外周PBMC中的7种主要的细胞类型,包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、非经典单核细胞、Medullary carcinoma经典单核细胞以及DC细NSC 127716胞。在肺组织中,还检测到纤毛细胞、成纤维细胞、内皮细胞、线索细胞和肺泡上皮细胞5种组织细胞。各类细胞百分比差异分析显示,疫苗免疫-病毒感染后,外周血中,T、B淋巴细胞减少,NK和单核细胞增加;肺组织中B细胞和NK细胞以及肺纤毛细胞增加。转录组分析发现攻毒后,疫苗组的PBMC中的NKT细胞在急性感染期迅速增加,上调的差异基因在与“细胞毒性”、“免疫细胞活化和分化”相关的通路中富集,并与其他类型免疫细胞交互作用程度增加。在肺组织中,疫苗组中Th细胞百分比增加、Th1型细胞因子获悉更多的表达水平也增加并且差异基因在“Th1和Th2分化”通路上富集。此外,攻毒后D3天两组单核细胞中均观察到了上调的Ⅰ型IFN抗病毒反应,但对照组在感染中期D6天就检测到了下降。另外,疫苗组中的单核细胞中的“急性炎症反应”通路和炎性细胞因子的基因表达水平较对照组低。而在DC亚群中,我们发现在攻毒后D3天的PBMC和肺组织中,对照组pDC亚群明显高于疫苗组,但对照组pDC的Ⅰ型IFN抗病毒反应主要在PBMC中上调,而在肺组织中缺失,这与疫苗组的变化相反。此外,疫苗组肺组织中的各种组织细胞在攻毒后D6天细胞数量增加高于对照组,尤其是纤毛细胞,功能分析显示疫苗组纤毛细胞的功能在与“纤毛组装”、“纤毛运动”等通路显著富集。检测纤毛细胞的Ⅰ型IFN反应发现相比疫苗组,对照组纤毛细胞在感染后急性期D3天抗病毒反应同时伴随炎性反应的明显上调。此外,NK细胞也介导灭活疫苗的保护性免疫反应。SARS-CoV-2灭活疫苗导致外周PBMC和肺组织中CD56DimCD16Bright NK细胞亚群百分比增多。功能分析发现疫苗组中NK细胞的“Ⅰ型IFN反应”通路的基因簇的表达水平从攻毒后D0天开始下调并持续到D6天,而“IFN-γ反应”、“细胞毒性”和“抗病毒防御反应”通路的基因簇表达水平变化趋势与之完全相反。相比而言,对照组中的NK细胞在攻毒后其“Ⅰ型IFN反应”通路的基因簇的表达水平在D3天到达高峰后开始下降,并且未检测到“IFN-γ反应”和“细胞毒性”通路的基因簇的表达。对NK细胞的功能进行体外验证,结果显示疫苗组的NK细胞对K562的细胞杀伤功能高于对照组。而其功能的改变与NK细胞的活化性受体和抑制性受体表达水平改变有关。最后,疫苗组NK细胞可诱导SARS-CoV-2特异性记忆性反应,表现为再次受到SARS-CoV-2抗原刺激时,NK细胞亚群出现快速增殖、细胞因子IFN-γ、TNF-α和细胞毒性颗粒GZMB的释放增加以及抗原特异性的细胞毒性功能的增加。同时,转录组和体外功能试验发现,相比对照组,疫苗组中PBMC和肺组织中NK细胞的KLRC2受体表达水平升高。总之,我们的研究表明除了中和抗体以外,灭活疫苗可以诱导外周循环中NKT细胞和肺组织中CD4+辅助性T细胞早期的快速增加,这有利于促进SARS-CoV-2的快速消退以及活化随后的天然和适应性免疫反应。同时,灭活疫苗可以减弱SARS-CoV-2感染中单核细胞诱导的炎症反应、阻止肺组织中pDC细胞Ⅰ型抗病毒IFN反应的抑制以及逆转感染导致的肺组织细胞的丧失。此外,CD56DimNK亚群介导了灭活疫苗的保护作用。疫苗组中的NK细胞对靶细胞的细胞毒性功能增强与早期下调的Ⅰ型IFN反应信号通路相关。同时,面对SARS-CoV-2的感染时,疫苗组NK细胞受体多样性水平降低,并倾向于诱导快速增殖、IFN-γ释放增加和细胞毒性功能增强的记忆样NK细胞亚群特征。本研究提供了灭活疫苗免疫后恒河猴体内PBMC和肺组织的单细胞水平的天然和适应性高分辨率转录图谱以及解析了与灭活疫苗保护性相关的NK细胞反应,这将有助于更好地理解新冠肺炎灭活疫苗产生的保护性免疫反应,为灭活疫苗更的免疫原性的全面评估提供有价值的参考信息。