背景:肿瘤免疫治疗通常是指利用多种手段恢复或激活以T淋巴细胞为主的免疫细胞的效应能力,从而达到特异性识别和杀伤肿瘤细胞的治疗方法。与传统的放疗、细胞INCB28060研究购买毒性化疗和分子靶向治疗不同,肿瘤免疫疗法主要作用于机体的免疫细胞,而不是肿瘤细胞,这是肿瘤免疫治疗最为独特的地方。随着人们对免疫系统特别是肿瘤免疫逃逸机制研究的深入,肿瘤免疫疗法逐渐成为临床肿瘤治疗的中坚力量。免疫检查点阻断疗法是目前肿瘤免疫治疗最常见的类型,该疗法已在多种实体瘤及血液肿瘤的治疗中表现出卓越疗效。免疫检查点是指免疫系统中抑制性信号通路上的关键蛋白,它们对于维持正常器官稳态、限制自身免疫过强起着至关重要的作用。肿瘤细胞利用免疫检查点信号通路抑制T细胞的活化,是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。临床上,多个免疫检查点阻断疗法在肿瘤治疗中取得了良好的效果,其中疗效最为确证的是针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic-T-lymphocyte associated protein 4,CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death 1,PD-1)及其配体(programmed cell death ligand 1,PD-L1)这3种免疫检查点分子的阻断剂。然而这些免疫检查点抑制剂在肿瘤患者中的客观缓解率(objective response rate,ORR)仍然不高,对于免疫治疗反应比较好的黑色素瘤、非小细胞肺癌及尿路上皮癌等,ORR也只有30～40%,主要原因是肿瘤的异质性和不稳定性导致免疫原性较低,即便阻断了抑制性免疫通路,肿瘤细胞仍然无法被机体免疫系统识别并清除。此外,目前获批上市的免疫检查点抑制剂均为单克隆抗体,它们对免疫检查点的封闭效果有限并且组织渗透性差,这也是反应率不高的原因。免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)是指某些蒽环类化疗药物或放疗等诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时,会上调某些具有免疫原性的蛋白分子如钙网蛋白(calreticulin,CRT)在细胞表面表达及高迁移率簇蛋白1(high mobility group box protein 1,HMGB1)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的释放,这些蛋白分子能够促进树突状细胞成熟,进而激活T淋巴细胞对肿瘤细胞特异性杀伤。ICD和免疫检查点阻断疗法联合可以弥补后者的不足,起到协同作用。小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)是一类长度为20～25个碱基对的双链RNA分子,能识别并切割特异序列的信使RNA(messenger RNA,m RNA),相比于以抗体为代表的蛋白封闭疗法,si RNA将高效的降解能力与特异性的识别能力结合,能够从m RNA水平下调靶基因的表达,而且还具有合成周期短、成本低、效率高等优点,在肿瘤基因治疗领域具有广阔的应用前景。通过阿霉素(doxorubicin,DOX)介导的ICD和si PD-L1介导的免疫检查点阻断疗法可以实现优势互补,发挥强大的抗肿瘤疗效。然而DOX具有很强的细胞毒性,对正常组织也有杀伤作用,而且si PD-L1作为小核酸易降解,因此需要构建安全、高效的载体实现上述组分的共递送,从而降低DOX外溢并保护si PD-L1。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)目前最有效的非病毒基因转染载体之一,已经成为非病毒载体领域衡量其他类型载体转染效率的“金标准”。PEI分子含有大量氨基,在溶酶体低p H条件下能够产生很强的“质子海绵”效应,有利于基因分子从溶酶体逃逸。虽然PEI具有较高的基因转染效率,但因毒性大、缺少细胞或组织靶向性等缺点,限制了其实际应用。因此许多研究致力于PEI的结构修饰来提高其安全性及体内转染效率。目的:本研究以PEI为基础,设计了一种具有高转染效率、低细胞毒性的DOX和si PD-L1共递送载体,实现了ICD和免疫检查点阻断疗法联合治疗的目的。内容:1.PEI与3-马来酰亚胺基丙酰肼(3-maleimidopropionic acid hydrazide,BMPH)通过巯基点击反应合成PEI-BMPH(PM),DOX通过腙键与PM键合形成PE1-BMPH-DOX(PMD)。通过~1H NMR对结构进行表征,证实PMD成功合成,PMD复合物中DOX的载药量约为14%,并且具有酸敏感型药物释放的特性。由于与BMPH结合后PEI表面的正电荷被遮蔽,因此PM载体具有较低的细胞毒性。凝胶阻滞实验和RNase A保护实验表明,PMD对si PD-L1有semen microbiome良好的组装和保护能力。通过优化转染比,确定以质量比为8构建PMD/si PD-L1纳米复合物。纳米复合物被细胞内化后,在溶酶体酸性环境下腙键断裂,DOX释放并进入细胞核干扰DNA合成,si PD-L1可借助PEI强大的“质子海绵”效应而从溶酶体逃逸至胞质降解PD-L1 m RNA。肿瘤细胞凋亡和增殖抑制研究表明,PMD/si PD-L1有很强的抗肿瘤效应。同时,PMD/si PD-L1能显著降低PD-L1表达,抑制DOX诱导的PD-L1上调。不仅如此,PMD/si PD-L1和DOX类似,都能诱导肿瘤IDN-6556分子量细胞产生ICD反应,促进CRT暴露、HMGB1和ATP释放,介导树突状细胞成熟、T淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。2.在小鼠肺转移瘤模型中,PMD利用p H敏感的腙键控制DOX释放,减少对正常组织的损伤,并使DOX在肿瘤部位长时间维持在较高浓度,诱发ICD提高肿瘤免疫原性。此外,PMD也能很好地介导si PD-L1在肿瘤组织蓄积,降低肿瘤组织PD-L1表达,阻断免疫检查点通路。这两种策略协同作用使得PMD/siPD-L1处理过的小鼠肿瘤组织具有更多的树突状细胞、CD8~+T淋巴细胞浸润及细胞因子释放,进而在体内展现出良好的抗肿瘤效果。结论:综上,本研究构建了一种PEI衍生物为载体的DOX和si PD-L1共递送体系,实现了si PD-L1的高效、稳定递送和DOX的可控释放,通过免疫检查点阻断和ICD协同作用,达到了良好的肿瘤抑制效果,为肿瘤免疫治疗载体的设计与评价搭建了良好的平台,并为新型肿瘤免疫治疗策略的临床应用奠定了坚实的基础。