pH敏感型载体介导免疫检查点阻断疗法与免疫原性细胞死亡联合抗肿瘤研究

背景:肿瘤免疫治疗通常是指利用多种手段恢复或激活以T淋巴细胞为主的免疫细胞的效应能力,从而达到特异性识别和杀伤肿瘤细胞的治疗方法。与传统的放疗、细胞INCB28060研究购买毒性化疗和分子靶向治疗不同,肿瘤免疫疗法主要作用于机体的免疫细胞,而不是肿瘤细胞,这是肿瘤免疫治疗最为独特的地方。随着人们对免疫系统特别是肿瘤免疫逃逸机制研究的深入,肿瘤免疫疗法逐渐成为临床肿瘤治疗的中坚力量。免疫检查点阻断疗法是目前肿瘤免疫治疗最常见的类型,该疗法已在多种实体瘤及血液肿瘤的治疗中表现出卓越疗效。免疫检查点是指免疫系统中抑制性信号通路上的关键蛋白,它们对于维持正常器官稳态、限制自身免疫过强起着至关重要的作用。肿瘤细胞利用免疫检查点信号通路抑制T细胞的活化,是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。临床上,多个免疫检查点阻断疗法在肿瘤治疗中取得了良好的效果,其中疗效最为确证的是针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic-T-lymphocyte associated protein 4,CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death 1,PD-1)及其配体(programmed cell death ligand 1,PD-L1)这3种免疫检查点分子的阻断剂。然而这些免疫检查点抑制剂在肿瘤患者中的客观缓解率(objective response rate,ORR)仍然不高,对于免疫治疗反应比较好的黑色素瘤、非小细胞肺癌及尿路上皮癌等,ORR也只有30~40%,主要原因是肿瘤的异质性和不稳定性导致免疫原性较低,即便阻断了抑制性免疫通路,肿瘤细胞仍然无法被机体免疫系统识别并清除。此外,目前获批上市的免疫检查点抑制剂均为单克隆抗体,它们对免疫检查点的封闭效果有限并且组织渗透性差,这也是反应率不高的原因。免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)是指某些蒽环类化疗药物或放疗等诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时,会上调某些具有免疫原性的蛋白分子如钙网蛋白(calreticulin,CRT)在细胞表面表达及高迁移率簇蛋白1(high mobility group box protein 1,HMGB1)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的释放,这些蛋白分子能够促进树突状细胞成熟,进而激活T淋巴细胞对肿瘤细胞特异性杀伤。ICD和免疫检查点阻断疗法联合可以弥补后者的不足,起到协同作用。小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)是一类长度为20~25个碱基对的双链RNA分子,能识别并切割特异序列的信使RNA(messenger RNA,m RNA),相比于以抗体为代表的蛋白封闭疗法,si RNA将高效的降解能力与特异性的识别能力结合,能够从m RNA水平下调靶基因的表达,而且还具有合成周期短、成本低、效率高等优点,在肿瘤基因治疗领域具有广阔的应用前景。通过阿霉素(doxorubicin,DOX)介导的ICD和si PD-L1介导的免疫检查点阻断疗法可以实现优势互补,发挥强大的抗肿瘤疗效。然而DOX具有很强的细胞毒性,对正常组织也有杀伤作用,而且si PD-L1作为小核酸易降解,因此需要构建安全、高效的载体实现上述组分的共递送,从而降低DOX外溢并保护si PD-L1。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)目前最有效的非病毒基因转染载体之一,已经成为非病毒载体领域衡量其他类型载体转染效率的“金标准”。PEI分子含有大量氨基,在溶酶体低p H条件下能够产生很强的“质子海绵”效应,有利于基因分子从溶酶体逃逸。虽然PEI具有较高的基因转染效率,但因毒性大、缺少细胞或组织靶向性等缺点,限制了其实际应用。因此许多研究致力于PEI的结构修饰来提高其安全性及体内转染效率。目的:本研究以PEI为基础,设计了一种具有高转染效率、低细胞毒性的DOX和si PD-L1共递送载体,实现了ICD和免疫检查点阻断疗法联合治疗的目的。内容:1.PEI与3-马来酰亚胺基丙酰肼(3-maleimidopropionic acid hydrazide,BMPH)通过巯基点击反应合成PEI-BMPH(PM),DOX通过腙键与PM键合形成PE1-BMPH-DOX(PMD)。通过~1H NMR对结构进行表征,证实PMD成功合成,PMD复合物中DOX的载药量约为14%,并且具有酸敏感型药物释放的特性。由于与BMPH结合后PEI表面的正电荷被遮蔽,因此PM载体具有较低的细胞毒性。凝胶阻滞实验和RNase A保护实验表明,PMD对si PD-L1有semen microbiome良好的组装和保护能力。通过优化转染比,确定以质量比为8构建PMD/si PD-L1纳米复合物。纳米复合物被细胞内化后,在溶酶体酸性环境下腙键断裂,DOX释放并进入细胞核干扰DNA合成,si PD-L1可借助PEI强大的“质子海绵”效应而从溶酶体逃逸至胞质降解PD-L1 m RNA。肿瘤细胞凋亡和增殖抑制研究表明,PMD/si PD-L1有很强的抗肿瘤效应。同时,PMD/si PD-L1能显著降低PD-L1表达,抑制DOX诱导的PD-L1上调。不仅如此,PMD/si PD-L1和DOX类似,都能诱导肿瘤IDN-6556分子量细胞产生ICD反应,促进CRT暴露、HMGB1和ATP释放,介导树突状细胞成熟、T淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。2.在小鼠肺转移瘤模型中,PMD利用p H敏感的腙键控制DOX释放,减少对正常组织的损伤,并使DOX在肿瘤部位长时间维持在较高浓度,诱发ICD提高肿瘤免疫原性。此外,PMD也能很好地介导si PD-L1在肿瘤组织蓄积,降低肿瘤组织PD-L1表达,阻断免疫检查点通路。这两种策略协同作用使得PMD/siPD-L1处理过的小鼠肿瘤组织具有更多的树突状细胞、CD8~+T淋巴细胞浸润及细胞因子释放,进而在体内展现出良好的抗肿瘤效果。结论:综上,本研究构建了一种PEI衍生物为载体的DOX和si PD-L1共递送体系,实现了si PD-L1的高效、稳定递送和DOX的可控释放,通过免疫检查点阻断和ICD协同作用,达到了良好的肿瘤抑制效果,为肿瘤免疫治疗载体的设计与评价搭建了良好的平台,并为新型肿瘤免疫治疗策略的临床应用奠定了坚实的基础。