背景:缺血性脑卒中(Ischemic stroke,IS),是世界上仅次于心脏病的第二大死亡原因,其发病率仍在上升。大部分患者因缺血性脑卒中丧失了劳动能力,并给社会和家庭带来很大的负担。因此,预防和治疗缺血性脑卒中是当务之急的研究重点。缺血性脑卒中损伤的病理机制包括氧化应激、白细胞浸润、炎症和细胞凋亡。氧化应激是活性氧过量产生的结果,活性氧触发许多细胞和分子事件,导致DNA氧化损伤、蛋白质和脂质的氧化,最终诱导神经元死亡。前B细胞白血病同源盒转录因子1(Pre-B-cell leukemia homeobox transcription factor 1,PBX1),是同源转录因子的三氨基酸环延伸(Triple amino acid loop extension,TALE)家族成员。研究发现,PBX1在干细胞发育基因的调控、干性的维持及自我更新中扮演重要角色。也在调节细胞氧化应激和凋亡过程中起到重要作用。因此,PBX1是一个有前途的治疗靶点。人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,h UCMSCs)被认为是免疫豁免细胞,容易获取,不涉及伦理问题,在再生医学及临床医学中应用广泛。科学家利用脐带间充质干细胞进行了多项缺血性脑卒中的研究,因为其在分化、抗炎及抗氧化作用中起到了有效的治疗作用。但在研究过程中发现,缺血性脑卒中其内在的缺血缺氧的恶劣环境,严重影响脐带间充质干细胞的存活以及降低其生物学作用。开发一种新的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)治疗IS的方法势在必行。近年来大量研究表明,通过对间充质干细胞进行基因改造或其他预处理方式,可以增强MSCs抗氧化能力及存活率,进而提高治疗IS的效力。目的:探究PBX1在缺血性脑卒中的保护作用及其相关机制。方法:体外实验,研究对象:HT22和h UCMSCs。使用H_2O_2制作体外氧化损伤模型。在研究PBX1对HT22细胞的保护作用时将实验分组为:Control组、Vector组、PBX1组、Control+H_2O_2组、Vector+H_2O_2组、PBX1+H_2O_2组;在进行PBX1对h UCMSCs在氧化损伤条件下存活能力的研究时将实验分组为:Control组、Vector组、PBX1组、Control+H_2O_2组、Vector+H_2O_2组、PBX1+H_2O_2组;在h UCMSCs和HT22共培养体系的研究中将实验分组为:Control组、Control+H_2O_2组、MSC+H_2O_2组、MSC-Vector+H_2O_2组、MSC-PBX1+H_2O_2组。利用慢病毒方法构建过表达PBX1的目的细胞;细胞计数法测量增殖;CCK8法检测细胞活力;流式细胞术检测ROS及细胞凋亡;Annexin V-PI染色观察细胞凋亡形态;DCFH-DA染色观察ROS积累;Western blot检测细胞凋亡(AIF、CYT-C、Cleaved-Caspase3)及DNA损伤修复(γH2AX、PAR、PARP1、KU70、KU80、RAD51)相关蛋白的表达水平。体内实验,研究对象:C57BL/6小鼠。采用小动物麻醉机,异氟烷吸入麻醉。建立小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,采用立体定向小鼠脑室注射方式,将细胞移植入同侧侧脑室。将实验分组:Sham组、MCAO组、MSC+MCAO组、MSC-Vector+MCAO组、MSC-PBX1+MCAO组。采用Longa法进行神经功能评分;TTC染色测量梗死体积;制作石蜡切片,HE染色观察病变脑组织的病理变化;TUNEL染色观察凋亡情况;DHE染色观察ROS水平;Western blot检测脑皮层组织的凋亡及DNA损伤相关蛋白。统计分析:使用image J,Graphpad Prism 9对数据进行统计学分析。当P<0.05时,认为数据间差异具有统计学意义。结果:一:1、成功构建HT22氧化损伤模型,采用800μM H_2O_2作用HT22细胞6小时进行后续实验;H_2O_2诱导的HT22细胞凋亡主要是非caspaReactive intermediatesse依赖的。随着Dibutyryl-cAMP化学结构H_2O_2浓度增加,HT22存活率下降,800μM处理组HT22的细胞存活率明显低于对照组(P<0.0001)。随着H_2O_2作用时间的增加,细胞内ROS积累,从0.5小时开始ROS积累逐渐增多(P<0.0001),呈时间依赖性。从1小时开始出现ALY-188011核磁nnexin V染色单阳性细胞(P<0.0001),2小时出现Annexin V染色和PI染色双阳性细胞(P<0.05),并随时间延长双阳性细胞逐渐增多(6小时,P<0.0001)。凋亡蛋白CYT-C从3小时出现统计学差异(P<0.05),4小时差异最明显(P<0.01)。然而,Cleaved-caspase3始终无明显变化。AIF(57KDa)从3小时出现统计学差异(P<0.05),6小时有明显差异(P<0.001);AIF(67KDa)从3小时出现统计学差异(P<0.01),4小时差异最明显(P<0.0001),6小时略下降(P<0.01)。PAR从3小时逐渐升高(P<0.05),PARP1(89KDa)从3小时开始显著升高(P<0.0001)。2、成功构建过表达PBX1的HT22;PBX1上调内源性KU80、下调内源性AIF、CYT-C表达;在H_2O_2诱导的HT22氧化损伤中PBX1降低了AIF、CYT-C表达,减少凋亡;PBX1降低氧化损伤中γH2AX、PARP1(89KDa)表达减轻DNA的损伤;PBX1抑制氧化损伤中ROS的积累;PBX1对氧化损伤中的HT22细胞具有保护作用。PBX1组与Vector组相比:从第4天开始细胞数明显增多(P<0.05);蛋白水平,AIF(57KDa)、AIF(67KDa)、CYT-C下降(P值分别为:P<0.01,P<0.001,P<0.05);KU80升高(P<0.0001);PBX1升高(P<0.0001)。PBX1+H_2O_2组与Vector+H_2O_2组相比:细胞活力增加(P<0.0001);流式细胞术检测结果,凋亡率降低(P<0.0001)、ROS积累减少(P<0.0001)。蛋白水平,AIF(57KDa)、CYT-C下降(P值分别为:P<0.05,P<0.05);γH2AX,PARP1(89KDa)降低(P值分别为:P<0.01,P<0.05)、KU80升高(P<0.001);PBX1升高(P<0.0001)。二:1、成功构建过表达PBX1的h UCMSCs;PBX1降低了h UCMSCs的内源性PARP1、PAR、KU70、AIF的表达;PBX1减轻了H_2O_2诱导h UCMSCs凋亡、DNA损伤、ROS积累;PBX1增加了h UCMSCs在氧化损伤状态下的存活能力。PBX1组与Vector组相比:培养7天之后细胞数增多(P<0.05);蛋白水平,AIF(67KDa)、AIF(57KDa)、KU70、PARP1、PAR下降(P值分别为:P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.001);PBX1升高(P<0.0001)。PBX1+H_2O_2组与Vector+H_2O_2组相比:细胞活力提高(P<0.0001)。流式细胞术检测结果,凋亡率下降(P<0.0001)、ROS积累降低(P<0.05)。蛋白水平,Cleaved-caspase3、AIF-67、AIF-57、CYT-C下降(P值分别为:P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.05);PARP1(116KDa)、PAR、KU70、RAD51下降(P值分别为:P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05);PBX1升高(P<0.0001)。2、在h UCMSCs和HT22共培养体系中,过表达PBX1的h UCMSCs比h UCMSCs对H_2O_2诱导的HT22具有更好的保护作用。在共培养时间内,HT22细胞中PBX1蛋白的表达无统计学差异(ns,P>0.05)。MSC-Vector+H_2O_2组与Control+H_2O_2组相比:流式细胞术检测显示,凋亡率下降(P<0.0001)、ROS下降(P<0.001)。蛋白水平,AIF(67KDa)、AIF(57KDa)、CYT-C降低(P值分别为:P<0.01,P<0.01,P<0.05);γH2AX、PAR、PARP1(89KDa)、KU70、RAD51降低(P值分别为:P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.01)。MSC-PBX1+H_2O_2组与MSC-Vector+H_2O_2组相比:流式细胞术检测结果,凋亡率下降(P<0.01)、ROS下降(P<0.001)。蛋白水平,AIF(67KDa)、AIF(57KDa)、CYT-C降低(P值分别为:P<0.01,P<0.01,P<0.05);γH2AX、PAR、PARP1(89KDa)降低(P值分别为P<0.001,P<0.01,P<0.01);然而,KU70、KU80、RAD51并无统计学差异(ns,P>0.05)。三:过表达PBX1的h UCMSCs在脑缺血再灌注损伤的小鼠模型中减轻了细胞凋亡、DNA损伤、ROS的累积,减少了脑梗死体积,改善神经功能。PBX1在脑缺血再灌注损伤中具有保护作用。MSC-PBX1+MCAO组与Sham组比较PBX1表达升高(P<0.05)。MSC-Vector+MCAO组与MCAO组相比:Longa神经功能评分降低(P<0.05);小鼠梗死体积明显减少(P<0.0001);HE染色,神经元损伤程度减轻,神经元数量增多,间隙略紧密;TUNEL染色,皮层区阳性细胞(绿色)下降(P<0.01);蛋白水平,Cleaved-Caspase3、CYT-C、AIF(67KDa)、AIF(57KDa)表达明显降低(P值分别为:P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01);γH2AX、PARP(89KDa)、PAR降低(P值分别为P<0.001,P<0.01,P<0.05);DHE染色,阳性细胞(红色)减少(P<0.05)。MSC-PBX1+MCAO组与MSC-Vector+MCAO组相比:Longa神经功能评分降低(P<0.05);梗死体积减少(P<0.05);HE染色,神经元损伤程度减轻,神经元数量增多,间隙紧密;TUNEL染色,皮层区阳性细胞(绿色)减少(P<0.01);蛋白水平,AIF(67KDa)、AIF(57KDa)下降(P值分别为:P<0.05,P<0.05);γH2AX、PARP(89KDa)、PAR降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01);DHE阳性细胞(红色)减少(P<0.01)。结论:1、PBX1下调HT22细胞内源性AIF、CYT-C的表达,上调内源性KU80的表达,抑制了神经元氧化损伤中ROS的积累、减轻DNA损伤和细胞凋亡。2、PBX1在神经元氧化损伤中起到保护作用。3、过表达PBX1的脐带间充质干细胞对脑缺血再灌注损伤保护作用要优于单纯脐带间充质干细胞的保护作用。