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目的：明确肾气丸对肾阳虚证大鼠水液代谢紊乱的调控作用，初步探索其作用机制。方法：将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、肾Selenocysteine biosynthesis气丸低剂量组和肾气丸高剂量组，每组10只。模型组及给药组给予200 mg·kg~(-1)·d~(-1)腺嘌呤悬浊液连续灌胃20 d，其中两给药组从实验第15天开始，连续灌胃1.5、3.0 g/kg肾气丸14 d。观察大鼠一般状况、症状体征（体质量、肛www.selleck.cn/products/BAY-73-4506温、饮水量、尿量、脱毛、拱背、蜷缩及抓取激惹反应）；收集大鼠24 h尿液，Elisa法测定17羟皮质类固醇（17-OHCS）含量；心脏取血，取小鼠下丘脑、肾髓质组织并匀浆，全自动生化仪测定大鼠肾功能指标，Elisa法测定血清促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（CORT）含量，下丘脑血管加压素（AVP）、促肾上腺皮质激素释放因子（CRH）含量，血管加压素V2受体（V2R）、糖皮质激素受体NVP-TNKS656临床试验-α(GCR-α）、水通道蛋白2(AQP2）、环磷酸腺苷酸（cAMP）、蛋白激酶A(PKA）含量。HE和Masson染色观察肾组织变化。结果：与模型组比较，肾气丸高剂量组能显著提高大鼠体质量（第21、28天）、肛温（P<0.05,P<0.01），减少饮水量与尿量（P<0.01），升高大鼠下丘脑CRH、血清ACTH、CORT和尿17-OHCS含量（P<0.01），并明显改善肾损伤病理与肾功能指标。肾气丸高剂量组显著提高大鼠下丘脑AVP含量、肾髓质GCR-α、V2R、cAMP、PKA和AQP2含量（P<0.01）。结论：肾气丸改善肾阳虚大鼠水液代谢紊乱可能是通过调控AVP-V2R-c AMP-PKA-AQP2通路实现的。

目的:探讨美洲大蠊(Periplaneta Americana)提取物PA-B与CⅡ-3改善化疗所致骨髓抑制的药效,并探讨PA-B与CⅡ-3对化疗所致骨髓造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)损伤的保护作用及其机制。方法:(1)取昆明种小鼠,使用环磷酰胺(Cytoxan,CTX)建立骨髓抑制模型,并同时使用PA-B、CⅡ-3与人参皂苷Rg 1进行干预,连续给药14 d。每日记录小鼠的体重与一般状态;给药14 d后,测量小鼠的脏器指数与骨髓有核细胞数;检测小鼠外周血中白细胞(White blood cell,WBC)、红细胞(Red blood cell,RBBaricitinib供应商C)、血小板(Platelet,PLT)数量与血红蛋白(Hemoglobin,HGB)浓度;取小鼠股骨进行HE染色,检测其病理变化;检测小鼠骨髓有核细胞的细胞周期;使用ELISA法检测小鼠血清中白介素-3(Interleukin-3,IL-3)、IL-6与促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)的水平;检测小鼠血清中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活力与丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的水平;使用流式细胞术检测小鼠骨髓中CD3~-Sca-1~+c-kit~+HSCs(LSK HSCs)的含量。(2)使用磁珠分选法(Magnetic cell separation system,MACS)从小鼠骨髓中分离CD117~+HSCs,使用流式细胞术检测CD117~+HSCs含量;使用免疫印迹法(Western blot,WB)检测CD117~+HSCs中Rb1、p53、p21与p16蛋白的表达。结果:(1)小鼠的一般状态观察:PA-B与CⅡ-3能够改善CTX导致的小鼠毛发不顺、掉毛。PA-B与CⅡ-3给药组小鼠身体和精神状态良好。给药的14 d期间,各组小鼠的体重持续增加,趋势一致。(2)外周血细胞计数:给药第7 d,PA-B与CⅡ-3能够提高小鼠外周血中WBC数量(P<0.001),且PA-B的效果优于CⅡ-3(P<0.05或P<0.01)。给药第14 d,PA-B与CⅡ-3各剂量均能显著提高小鼠外周血中WBC、RBC、PLT数量与HGB浓度(P<0.001),PA-B提高小鼠外周血中WBC数量的效果优于CⅡ-3(P<0.01或P<0.001)。(3)小鼠脏器指数:PA-B与更多CⅡ-3各剂量均能显著提高小鼠的脾脏指数、胸腺指数与肺脏指数(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。PA-B各剂量改善CTX导致的脾脏指数下降的效果优于CⅡ-3各剂量(P<0.001),高剂量PA-B提高肺脏指数的效果优于高剂量的CⅡ-3(P<0.001)。各组小鼠心脏指数、肝脏指数与肾脏指数无显著性差异。(4)骨髓有核细胞计数:PA-B与CⅡ-3各剂量均能显著提高小鼠骨髓有核细胞数(P<0.01或P<0.001),且呈剂量依赖性。低、中剂量的PA-B提高骨髓有核细胞数的效果优于低、中剂量的CⅡ-3(P<0.01)。(5)股骨HE染色:PA-B与CⅡ-3各剂量均能够改善CTX导致的骨髓组织结构破坏、骨髓细胞排列紊乱、细胞间的密度显著减少、脂肪空泡显著增多等病理现象。(6)骨髓有核细胞细胞周期:模型组小鼠骨髓有核细胞增殖指数(Proliferation index,PI)与正常组相比无显著性差异(P>0.05)。PA-B与CⅡ-3给药genetic exchange能够降低小鼠骨髓细胞G0/G1期比例,提高S期比例与G2/M期比例,提高PI指数(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。PA-B与CⅡ-3组小鼠骨髓有核细胞PI无显著差异。(7)小鼠血清中IL-3、IL-6与EPO水平:PA-B与CⅡ-3均显著提高小鼠血清中IL-3水平(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。CⅡ-3能够显著提高小鼠血清中IL-6水平(P<0.001),而PA-B对小鼠血清中IL-6水平无显著影响。高剂量CⅡ-3与中、高剂量的PA-B能够显著提高小鼠血清中EPO的水平(P<0.05或P<0.01)。PA-B各剂量组小鼠血清中IL-3水平和EPO水平与CⅡ-3各剂量组相比无显著差异。(8)小鼠血清中SOD活力与MDA水平:PA-B与CⅡ-3给药显著提高了小鼠血清中SOD活力,降低了MDA水平(P<0.001)。PA-B各剂量组小鼠血清中SOD活力和MDA水平与CⅡ-3各剂量组相比无显著差异。(9)小鼠骨髓中LSK HSCs含量:PA-B与CⅡ-3各剂量给药显著提高了小鼠骨髓中LSK HSCs含量(P<0.01或P<0.001)。PA-B改善CTX导致LSK HSCs含量下降的效果显著优于CⅡ-3(P<0.01或P<0.001)。(10)MACS分离CD117~+HSCs:磁珠分选后小鼠骨髓CD117~+HSCs纯度为(87.23±1.78)%,磁珠分选能显著提高CD117~+HSCs纯度(P<0.001)。(11)WB:PA-B与CⅡ-3显著降低了小鼠CD117~+HSCs中Rb1、p53、p21与p16蛋白表达(P<0.001)。PA-B+CTX组小鼠CD117~+HSCs中p53与p21蛋白水平显著低于CⅡ-3+CTX组,而p16蛋白水平显著高于CⅡ-3+CTX组(P<0.01或P<0.001)。结论:(1)PA-B与CⅡ-3均能够改善CTX所致的小鼠骨髓抑制;(2)PA-B改善CTX所致的小鼠造血功能损害的效果优于CⅡ-3;(3)PA-B与CⅡ-3均能改善CTX所致的小鼠HSCs损害,恢复小鼠造血功能,其机制可能是降低小鼠CD117~+HSCs中Rb1、p53、p21与p16蛋白表达。

目的 了解江苏省徐州市手足口病（HFMD）和疱疹性咽峡炎（HA）病例肠道病毒病原谱特征，分析柯萨奇病毒A6型（CoxA6）、柯萨奇病毒A4型（CoxA4）、柯萨奇病毒A10型（CoxA10）完整VP1区基因特征。方法 用实时荧光定量PCR法和巢式PCR法检测HFMD和HA病例标本的肠道病毒血清型；对阳性标本用人横纹肌肉瘤细胞分离病毒，进行VP1区selleck化学基因测序；基NN2211半抑制浓度于VP1区全基因序列构建系统进化树，进行同源性分析。结果 2021年徐州市引起HFMD的前四位优势肠道病毒是Cox A6、柯萨奇病毒A16型（Cox A16）、Cox A10和Cox A4；引起HA的是Cox Amedicinal chemistry4、Cox A10、柯萨奇病毒A2型（Cox A2）和Cox A6。基于VP1区基因构建的系统进化树显示，Cox A6、Cox A10、Cox A4毒株分别为D3a亚型、C2亚型、C2亚型，与中国近年流行株亲缘关系较近；2种疾病分离毒株的VP1区基因无明显差异。结论 2021年徐州市HFMD和HA病例的病原谱不完全一致；Cox A10和Cox A4在2种疾病中都属于重要血清型，并和Cox A6、Cox A16共同流行；应持续开展HFMD和HA病原谱变化和病毒基因变异监测，预防疾病暴发。

枫杨属(Pterocarya)植物在我国分布很广,主要分布于华北、华中、华东、华南及西南等地,多生长于溪流河边或潮湿的山坡上,其树枝、树叶、花朵和果实等不仅具有极高的观赏价值,而且该属植物具有丰富的药理活性及防治有害生物等作用,例如抑制肿瘤活性、抗氧化、抗菌、抗炎、治疗鱼病和灭螺等,在民间该属植物是一种常用的中药,可以治疗各种细菌和真菌性皮肤疾病。但关于枫杨属植物的研究目前仅限于IACS-10759浓度东京枫杨和湖北枫杨等有限的几种且PLX-4720分子式对其有效成分的组成、相关的药理活性及其用途并未进行系统的研究,对于山东特有的水胡桃(Pterocaryarhoifolia)的研究鲜有。为了更好地了解该属植物的化学成分,本文对该属植物水胡桃叶中的化学成分进行了比较系统的分离和纯化,并对该属植物的药理活性进行了初步的研究。主要研究内容及成果包括:(1)水胡桃叶子粗提物的活性初探。以水胡桃叶为原料,采用85%乙醇作为提取溶剂浸泡一定时间后得浸提物,随后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对其进行萃取,获得不同极性部位,并初步测定各部位的抗氧化、抗炎、抗菌及抗肿瘤生物活性,结果表明乙酸乙酯部位各活性最强medical competencies。(2)对活性最强的乙酸乙酯部位进行系统的分离和提纯。采用硅胶柱和凝胶柱层析(Sephadex LH-20)等方法对水胡桃叶乙醇浸提物的乙酸乙酯萃取相进行多次分离提纯并鉴定其结构及分析其物理化学特性,最终得到四种化合物分别为(4S)-4,8-二羟基-1-四氢萘酮(56 mg)属于萘醌类化合物、4-甲氧基-5-羟基-1-四氢萘酮(17 mg)、黄酮类化合物杨梅素(myricetin,22 mg)及β-谷甾醇(50 mg)属于类甾体化合物。采用MTT法对分离提纯得到的(4S)-4,8-二羟基-1-四氢萘酮及杨梅素(myricetin)的抗肿瘤作用进行测定,结果显示(4S)-4,8-二羟基-1-四氢萘酮及杨梅素(myricetin)对人体肝癌细胞Hep-G2和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖均表现出了一定的拮抗作用,其IC_(50)分别为74.99±2.14μg/mL、54.50±1.97μg/mL和63.99±2.67μg/mL、37.13±2.31μg/mL。(3)对水胡桃叶子石油醚粗提物采用气相色谱与质谱联用(GC-MS)技术鉴定其挥发性成分的组成。GM-MS检测结果显示水胡桃叶石油醚粗提物中的成分多以脂肪酸为主,例如棕榈酸的相对含量是36.92%、亚麻酸的相对含量是26.50%、亚油酸的相对含量是12.21%、肉豆蒄酸的相对含量是5.54%和硬脂酸是1.57%等。除了这些物质之外,还有一些其他的物质,如烷烃、烯烃及植醇等。(4)利用响应面法和正交试验等方法研究了水胡桃叶中萘醌类成分及黄酮类成分的最佳提取工艺。首先通过单因素实验明确了影响萘醌类成分及黄酮类成分提取含量的主要因素,再分别采用响应面法和正交试验,对萘醌类成分和黄酮类成分的提取工艺进行优化。结果表明当以60%乙醇、1:40(g/mL)的料液比、50℃的提取温度及6 h的提取时间为萘醌类成分的提取条件时提取效果最优,其提取量为106.37mg/g;当以75%乙醇、1:30(g/mL)的料液比、180 W超声功率及45 min超声时间为黄酮类成分的提取条件时提取效果最优,其提取量为28.54 mg/g。

重金属污染是现下最热门且紧迫的问题,超量的重金属会严重阻碍植物的生长和发育;且重金属可以通过食物链积累,威胁人类的健康。因此,如何修复土壤及水体中的重金属是环境治理的重要难题。而植物修复是减缓重金属污染的最为经济、环保的方法。加拿大飞蓬(Erigeron canadensis,Asteraceae)是一年生入侵植物,具有生物量大,适应性强,繁殖速度快等特点。本试验采集到来自贵州汞矿区的一株飞蓬的种子,通过重金属水培实验证实了该株系对多种重金属胁迫(镉、铅及汞)具有很强的耐受性;生理生化指标显示:重金属胁迫下,飞蓬的部分抗氧化物酶活性显著提高;基于CdCl_2胁迫下的转录组分析,证实飞蓬部分信号转导、激素合成相关基因响应了镉胁迫。具体研究结果如下:1.飞蓬在不同浓度的CdCl_2、Pb Cl_2、Hg Cl_2溶液处理下,其表型变化不显著。在0.5 mmol/L,1 mmol/L和2 mmol/L CdCl_2溶液处理下,地下部分和地上部分的干物质中镉含量分别为178.72±6.23mg/kg和99.11±3.93 mg/kg,335.55±8.80 mg/kg和243.83±5.00mg/kg,891.80±32.86 mg/kg和317.57±14.85 mg/kg。在0.5 mmol/L,1 mmol/L和2 mmol/L CdCl_2溶液处理下,富集因子分别为1.76,2.17和1.41;转运因子分别为55.46%,72.67%,和35.61%。在1 mmol/L,2.5 mmol/L和5 mmol/L Pb Cl_2处理下,地下部分和地上部分的干物质中铅含量分别为45.50±1.54 mg/kg和1039.69±13.04 mg/kg,100.51±5.32 mg/kg和3241.43±133.93 mg/kg,188.89±2.51 mg/kg和4803.95±169.47 mg/kg。在1 mmol/L,2.5 mmol/L和5 mmol/L Pb Cl_2溶液处理下,铅富集因子分别为0.23,0.19和0.18;而转运因子分别为4.38%,3.10%和3.93%。在0.05 mmol/L,0.2 mmol/L和0.4 mmol/L Hg Cl_2溶液处理下,飞蓬地上部和地下部的汞富集量分别为12.58±0.74 mg/kg和113.65±5.27 mg/kg,83.03±3.51 mg/kg和2755.10±129.64 mg/kg,151.04±4.47 mg/kg和6014.92±164.24 mg/kg。在0.05mmol/L,0.2 mmol/L和0.4 mmol/L Hg Cl_2溶液处理下,飞蓬植株汞富集因子分别为1.25,2.07和1.88;转运因子分别为11.07%,3.01%和2.51%。以上结果表明,飞蓬具有较强的适应性,能够耐受高浓度Cd胁迫(2 mmol/L CdCl_2溶液),Pb胁迫(5 mmol/L Pb Cl_2溶液)及Hg胁迫(0.4 mmol/L Hg Cl_2溶液)。此外,在CdCl_2溶液处理下,飞蓬表现出较强的Cd积累能力,同时Cd的富集因子、转运因子也最大,是潜在的重金属累积器。2.不同CdCl_2溶液(0.5、1和2 mmol/L CdCl_2)处理可显著提高飞蓬部分抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)水平。在1 mmol/L CdCl_2处理下,超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性显著提高。不同Pb Cl_2溶液(1、2.5和5 mmol/L Pb Cl_2)处理可显著提高脯氨酸(Pro)水平;在5 mmol/L Pb Cl_2处理下,过氧化物酶(POD)和过氧化immune effect氢酶(CAT)活性显著提高,而谷胱甘肽还原酶(GR)活性在1 mmol/L Pb Cl_2时显著提高。不同Hg Cl_2溶液(0.05、0.2和0.4 mmol/L Hg Cl_2)处理可显著提高MDA和Pro水平,在0.4 mmol/L Hg Cl_2处理下,过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性显著提高。上述结果表明,受到重金属胁迫时,飞蓬的抗氧化酶活性增加,以应对重金属胁迫所带来的毒性,使其能正常的生长发育。3.为了获得Cd胁迫下飞蓬基因表达,对参照组(CK)和0.5mmol/L Cd~(2+)处理过的植物(Cd)基因表达水平进行转录组测序。在Cd胁迫下,飞蓬植物适应性生存而导致植物体内差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)地下部分有5284个(分别为3605个上调基因和1679个下调基因);地上部分有3815个(其中2430个上调基因和1385个下调基因),显著低于根中差异表达基因的数量。在两者比较中均发现了692个上调和136个下调的DEGs,并定义为共同DEGs。在Cd胁迫和对照组植株地上部分中发现有1132个差异基因(734个上调基因,398个下调基因);而在Cd胁迫和对照组植株地下部分中有1349个上调基因(937个上调基因和412个下调基因)注释到111条KEGG通路上。表明以上通路对Cd胁迫均有响应。进一步分析发现,在Cd胁迫下,植物激素信号通路在地上部分(53个DEGs)和地下部分(128个DEGs)中均显著富集。此外,上调和下调的共同DEGs主要参与了该通路。两种不同组织间selleckchem AG-221Auxin、ETH生物合成和信号转导相关基因表达水平的不同,可能导致地上部的Cd含量低于地下部分。此外,本研究还使用KEGG通路分析对与细胞壁生物合成、抗氧化酶和转录因子相关的DEGCanagliflozin半抑制浓度s进行了注释。关键DEGs的功能标记表明,信号转导、激素反应和活性氧(ROS)代谢对Cd有显著响应,特别是生长素(Auxin)和乙烯(ETH)信号转导参与的DEGs在地上部中表达过高,表明上述基因主要参与调节植物生长,因此可能通过调节响应胁迫,使飞蓬适应这种不利的环境。综上所述,飞蓬对多种重金属耐受,且可以作为Cd的潜在超累积器,为研究植物耐受重金属的分子机制提供了一定的理论支撑。

目的 探讨阿普米司特片治疗中重度斑块状银屑病疗效及安全性。方法 选取某院2021年3月～2022年12月收治的中重度斑块状银屑病80例，随机分为观察组（n=40）和对照组Genetic compensation（n=40）。对照组采用口服阿维A胶囊联合外用卤米松乳膏；观察组采用口服阿普米司特片联合外用卤米松乳膏。2组均干预16周。分析2组治疗前后PASI、DLQI变化情况；比Angiogenesis抑制剂较2组临床症状改善时间、临床疗效及不良反应情况。结果 观察组治疗后PASI、DLQI评分均低于对照组（P <0.05）；观察组皮肤瘙痒、红斑、鳞屑、脱屑等临床症状改善时间均较对照组缩短（P <0.05EPZ-6438半抑制浓度）；观察组临床总有效率高于对照组（P<0.05）；观察组治疗后IL-2、TNF-α、IFN-γ水平均低于对照组（P <0.05）；观察组不良反应发生率低于对照组（P<0.05）。结论 阿普米司特片能有效改善中重度斑块状银屑病患者临床症状及生活质量，不良反应少，临床疗效确切。

目的 探讨阿普米司特片治疗中重度斑块状银屑病疗效及安全性。方法 选取某院2021年3月～2022年12月收治的中重度斑块状银屑病80例，随机分为观察组（n=40）和对照组Genetic compensation（n=40）。对照组采用口服阿维A胶囊联合外用卤米松乳膏；观察组采用口服阿普米司特片联合外用卤米松乳膏。2组均干预16周。分析2组治疗前后PASI、DLQI变化情况；比Angiogenesis抑制剂较2组临床症状改善时间、临床疗效及不良反应情况。结果 观察组治疗后PASI、DLQI评分均低于对照组（P <0.05）；观察组皮肤瘙痒、红斑、鳞屑、脱屑等临床症状改善时间均较对照组缩短（P <0.05EPZ-6438半抑制浓度）；观察组临床总有效率高于对照组（P<0.05）；观察组治疗后IL-2、TNF-α、IFN-γ水平均低于对照组（P <0.05）；观察组不良反应发生率低于对照组（P<0.05）。结论 阿普米司特片能有效改善中重度斑块状银屑病患者临床症状及生活质量，不良反应少，临床疗效确切。

目的 探讨阿普米司特片治疗中重度斑块状银屑病疗效及安全性。方法 选取某院2021年3月～2022年12月收治的中重度斑块状银屑病80例，随机分为观察组（n=40）和对照组Genetic compensation（n=40）。对照组采用口服阿维A胶囊联合外用卤米松乳膏；观察组采用口服阿普米司特片联合外用卤米松乳膏。2组均干预16周。分析2组治疗前后PASI、DLQI变化情况；比Angiogenesis抑制剂较2组临床症状改善时间、临床疗效及不良反应情况。结果 观察组治疗后PASI、DLQI评分均低于对照组（P <0.05）；观察组皮肤瘙痒、红斑、鳞屑、脱屑等临床症状改善时间均较对照组缩短（P <0.05EPZ-6438半抑制浓度）；观察组临床总有效率高于对照组（P<0.05）；观察组治疗后IL-2、TNF-α、IFN-γ水平均低于对照组（P <0.05）；观察组不良反应发生率低于对照组（P<0.05）。结论 阿普米司特片能有效改善中重度斑块状银屑病患者临床症状及生活质量，不良反应少，临床疗效确切。

目的 探讨阿普米司特片治疗中重度斑块状银屑病疗效及安全性。方法 选取某院2021年3月～2022年12月收治的中重度斑块状银屑病80例，随机分为观察组（n=40）和对照组Genetic compensation（n=40）。对照组采用口服阿维A胶囊联合外用卤米松乳膏；观察组采用口服阿普米司特片联合外用卤米松乳膏。2组均干预16周。分析2组治疗前后PASI、DLQI变化情况；比Angiogenesis抑制剂较2组临床症状改善时间、临床疗效及不良反应情况。结果 观察组治疗后PASI、DLQI评分均低于对照组（P <0.05）；观察组皮肤瘙痒、红斑、鳞屑、脱屑等临床症状改善时间均较对照组缩短（P <0.05EPZ-6438半抑制浓度）；观察组临床总有效率高于对照组（P<0.05）；观察组治疗后IL-2、TNF-α、IFN-γ水平均低于对照组（P <0.05）；观察组不良反应发生率低于对照组（P<0.05）。结论 阿普米司特片能有效改善中重度斑块状银屑病患者临床症状及生活质量，不良反应少，临床疗效确切。

背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,全球每年有超过80万例的新发病例。其中,我国每年新发病例数约占全球的一半。HCC起病隐匿,超过80%的患者诊断时已至晚期,失去了根治性手术的机会,需接受系统性治疗。随着医学技术的不断进步,目前已经开发出多种系统性治疗方法应用于晚期HCC,如受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)抑制剂和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂等,但疗效有限。基于免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的免疫治疗给肿瘤患者带来了新的希望。然而其客观反应率(objective response rate,ORR)不到30%,疗效仍不尽如人意。肿瘤免疫治疗的研究离不开对肿瘤免疫微环境(tumor immune microenviroment,TIME)组成和功能的了解。然而,目前对HCC免疫微环境的解析尚不全面。TIME包含多种免疫活性细胞及免疫抑制细胞,是高度异质且复杂的。传统的高通量转录组测序(bulk RNA sequencing,bulk RNA-seq)技术将数以百万计的细胞进行集中测序,结果展示的只是大量细胞的平均表达或者是优势细胞群的表达水平,造成很多信息的缺失且忽视了细胞间的异质性。随着单细胞分离,基因扩增及测序技术的飞速发展,单细胞转录组测序(single cell RNA,sc RNA-seq)技术应运而生。该技术能对单个细胞的转录水平进行测序,可以准确地分析每一个细胞的基因表达水平且最大程度解析样本内的异质性。尽管科学家们已经在一定程度上解析了HCC的免疫细胞图谱,但HCC免疫抑制细胞的功能状态,尤其是免疫抑制细胞亚群的临床意义以及细胞间通讯尚需进一步探索。目的:本研究拟利用10X genomics单细胞RNA测序平台探索HCC免疫抑制细胞的构成及其功能状态,并对挖掘出来的关键细胞亚群和分子进一步验证。同时应用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库和本地患者队列进一步揭示关键细胞亚群的临床意义。尝试在单细胞视角下解析肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中复杂的相互作用网络,探究免疫抑制微环境中占主导的免疫检查点通路,为临床开发免疫治疗的新靶点及进一步优化免疫联合治疗提供理论基础。方法:1.sc RNA-seq及生信分析:将3例人HCC肿瘤及与其配对的3例癌旁组织进行组织解离,制备单细胞悬液,建库和上机测序。然后对下机数据进行质控及去批次。通过Seurat软件对各细胞亚群进行无监督聚类及注释分析。使用Monocle2进行发育轨迹分析,以探索细胞间潜在的谱系分化发育关系。通过基因集变异分析(gene set variation analysis,GSVA)进行功能富集分析。单细胞调节网络推理和聚类(single-cell regulatory network inference and clustering,SCENIC)用于分析不同细胞亚群间转录因子调控。使用Infer CNV推测细胞的拷贝数变异(copy number variation,CNV)用来识别是否为真肿瘤细胞。进一步通过Cell Phone DB2推算TME中复杂的细胞间相互作用网络。在各细胞亚群分析中,差异倍数(fold change,FC)>2且校正后的P<0.05的基因被定义为标记基因,细胞亚群分子标签值定义为log2转化后的平均标记基因TPM值。2.选取6例HCC患者的肿瘤病理组织切片,应用多色免疫荧光技术验证sc RNA-seq研究中发现的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAMs)亚群。此外,我们还通过收集5例HCC患者的新鲜肿瘤组织样本,应用流式细胞技术检测不同TAMs细胞亚群间免疫抑制分子的表达情况。我们随后还选取了6对HCC患者的肿瘤和肿瘤旁病理组织切片,应用多色免疫荧光技术进一步检测调节性树突状细胞(dendritic cell,DCs)的分布。同时我们还应用流式细胞术进一步检测5例新鲜肿瘤组织样本中调节性DCs细胞亚群和其他DCs细胞亚群间功能分子的表达差异。3.为探讨各细胞亚群的丰度和患者总生存率(overall survival,OS)的关系。本研究首先选取了TCGA数据库中369例HCC患者(TCGA LIHC队列)的RNA测序数据,通过转录本相对占比进行细胞类型识别(cell type identification by estimating the relative subsets of RNA transcripts X,Cibersort X)的机器学习算法来推算本研究中所鉴定的细胞类型在每个患者中的相对丰度。通过单因素Cox回归分析筛选和OS相关的细胞亚群。同时结合患者的年龄,性别,分级和TNM分期等临床资料,采用多因素Cox回归分析该关键细胞亚群丰度是否可以作为HCC患者的独立预后指标。4.本研究还纳入2019年10月至2020年01月在我院行手术治疗的42例HCC患者作为本地队列,进一步证实经TCGA数据库筛选的关键细胞亚群丰度的独立预后价值。本研究根据美国癌症联合会(American Joint Commitselleck激酶抑制剂tee on Cancer,AJCC)提出的TNM分期方案对HCC患者进行分期。肿瘤分级依照Edmondson-steiner病理分级标准。42例患者的组织样本均经过组织解离,制备单细胞悬液,应用流式细胞技术检测该细胞亚群的丰度。考虑到术后短时间内复发风险最高,之后逐渐降低,患者随访方案如下:术后的第1年每2-3个月随访一次,1年之后每3-4个月随访一次。本地队列的主要研究终点是OS。5.基于RTKs基因家族的表达模式,通过机器学习算法XGBoost来构建用于预测索拉非尼治疗有效性的模型。选用基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)GSE109211数据集中应用索拉菲尼治疗的HCC患者(N=140),通过R caret包随机分为训练集(N=70)和验证集(N=70)。同时采用TCGA数据库中应用索拉非尼治疗的HCC患者作为外部测试集。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)用于评估模型的敏感性和特异性。6.通过体外免疫细胞介导的细胞毒性实验,进一步探讨阻断TIGIT-PVRmedical insurance/PVRL2轴对HCC的治疗潜力。我们还采用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞毒性实验上清液中免疫细胞分泌颗粒酶B(granzyme B,GZMB)的浓度。结果:1.TAMs细胞浸润特征分析及验证(1)TAMs细胞聚类分析和验证:通过对髓系细胞无监督聚类发现,TAMs细胞呈现两分类(VCAN+TAMs和C1QC+TAMs),且这两群细胞同时表达M1和M2型TAMs相关基因。免疫荧光检测显示肿瘤组织中VCAN+TAMs和C1QC+TAMs的特异性标记基因S100A8和SLC40A1呈互斥信号,结果表明HCC组织中存在两群不同的巨噬细胞。(2)VCAN+TAMs和C1QC+TAMs两种细胞亚群的功能差异分析和验证:拟时序轨迹分析发现VCAN+TAMs细胞可极化为C1QC+TAMs细胞,同时M2评分也随之显著增加。在这一分化过程中,我们发现抑制性分子均上调,而辅助激活因子均下调。应用流式细胞术进一步证实相较于VCAN+TAMs细胞亚群,C1QC+TAMs细胞亚群显著高表达免疫抑制分子LAIR1和CD276。GSVA富集分析显示补体激活和细胞因子通路在VCAN+TAMs细胞中显著富集,而TGF-β1信号通路,WNT信号通路和肝癌转移通路在C1QC+TAMs细胞中特异性富集。(3)C1QC+TAMs细胞亚群丰度是HCC患者预后的独立危险因素:在TCGA LIHC队列中,通过单因素Cox分析发现C1QC+TAMs细胞亚群丰度与HCC患者较差的OS相关。多因素Cox回归分析发现C1QC+TAMs细胞亚群丰度是HCC患者预后的独立危险因素。在42例本地患者队列中,多因素Cox分析仍表明C1QC+TAMs细胞亚群丰度是一个独立于其他临床因素(年龄,性别,分级和TNM分期)的预后指标。结果表明C1QC+TAMs细胞亚群丰度是HCC患者预后的独立危险因素。2.DCs细胞浸润特征分析及验证(1)调节性DCs细胞表型的分析及验证:本研究发现HCC肿瘤组织中调节性DCs细胞亚群(LAMP3+DCs)高表达激活状态相关基因(CD80和CD83等);迁移相关基因(CCR7和FSCN1等);以及免疫抑制相关基因(CD274和PDCD1LG2等)。免疫荧光检测发现调节性DCs细胞主要存在于HCC肿瘤组织中。流式细胞技术分析显示HCC肿瘤组织中LAMP3+DCs细胞CCR7,CD80和CD274的表达显著增高。研究结果进一步佐证LAMP3+DCs细胞的迁移,激活和免疫调节特性。(2)调节性DCs细胞的功能分析:GSVA功能富集分析显示免疫应答激活和抗原呈递通路在调节性DCs细胞中均下调,而细胞因子-细胞因子受体相互作用在调节性DCs细胞中上调。且调节性DCs细胞高表达募集Treg细胞的细胞因子。在TCGA LIHC队列中,调节性DCs与Treg细胞的分子标签存在正相关。3.TME中抑制性细胞亚群的互作形成免疫抑制生态位基于细胞间通讯分析,本研究发现C1QC+TAMs细胞,调节性DCs细胞,Treg和耗竭性CD8+T细胞之间存在较强的细胞共抑制,共刺激,趋化和粘附的相互作用,从而形成免疫抑制生态位。调节性DCs细胞高表达CD80/CD86,ADORA2A和CD70,分别与Treg细胞上的CTLA4/CD28,ENTPD1和CD27结合,并可通过CCL19-CXCR3和CXCL10-CXCR3来募集Treg细胞。此外,调节性DCs细胞不仅可通过经典的免疫抑制途径,也可通过一种非经典免疫抑制途径TIGIT-PVR/PVRL2轴与耗竭性CD8+T细胞相互作用。C1QC+TAMs细胞和Treg细胞之间通过趋化因子(CCL18-CCR8)相互作用,进一步激活TME中Treg细胞的免疫抑制活性。C1QC+TAMs细胞通过免疫调节分子(HAVCR2-LGALS9)与耗竭性CD8+T细胞相互作用促进CD8+T细胞的耗竭。同时,在TCGA LIHC队列中,研究结果表明调节性DCs细胞,Treg细胞,耗竭性CD8+T和C1QC+TAMs细胞的分子标签呈现显著正相关。4.HCC肿瘤细胞具有瘤内外的异质性(1)HCC肿瘤细胞CNV模式分析:HCC肿瘤细胞的CNErastin纯度V分析显示每例HCC患者均存在特定的CNV模式。(2)HCC肿瘤细胞RTKs基因家族表达模式分析及索拉菲尼治疗预测模型的构建和评估:本研究进一步分析了RTKs基因家族在肿瘤细胞中的表达谱,结果显示RTKs基因表达也以患者特异的方式富集。基于RTKs基因家族的表达模式,我们通过机器学习算法XGBoost构建模型来预测HCC患者应用索拉非尼治疗的完全缓解或部分缓解(complete response or partial response,CR/PR)。结果显示验证集ROC曲线下面积(area under the ROC curve,AUC)为0.982,测试集AUC值为0.889。结果表明该模型可以有效预测HCC患者应用索拉菲尼治疗的疗效。(3)HCC肿瘤细胞中不同细胞亚群及患者间信号通路富集分析:利用GSVA功能富集分析发现不同HCC患者中存在不同的肿瘤细胞信号通路富集。此外,不同细胞亚群间信号通路的富集也不同,显示肿瘤细胞呈瘤内外的异质性。5.TIGIT-PVR/PVRL2轴是HCC患者潜在的免疫治疗靶点(1)肿瘤浸润免疫细胞和抗原提呈细胞间的通讯分析:本研究通过评估共抑制和共刺激免疫检查点在形成HCC免疫抑制微环境中的相对贡献时发现共抑制信号TIGIT-PVR/PVRL2轴在肿瘤浸润免疫细胞和抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)通讯中占主导地位。肿瘤浸润免疫细胞和APCs细胞未通过经典的免疫抑制CTLA4-CD80/CD86和PD-1(PDCD1)-PD-L1/L2(CD274/PDCD1LG2)通路形成有效的通讯。(2)PVR/PVRL2表达和预后分析:TCGA LIHC转录组数据显示,HCC肿瘤组织中PVR和PVRL2显著上调。分析来自人类蛋白图谱数据库(human protein atlas,HPA)的免疫组化(immunohistochemistry,IHC)数据,我们发现与正常肝脏样本相比,HCC肿瘤组织高表达PVR和PVRL2。在TCGA LIHC队列中,PVR和PVRL2的高表达与HCC患者较差的OS存在显著相关。(3)阻断TIGIT-PVR/PVRL2轴可增强免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用:体外免疫细胞介导的细胞毒性实验显示,对肝癌细胞系进行PVR或PVRL2抗体阻断或对免疫细胞进行TIGIT阻断均可增强免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用。研究结果表明在增强免疫反应的同时还伴有上清液中GZMB的分泌增多。结论:1.HCC肿瘤微环境中TAMs细胞呈现VCAN+TAMs细胞和C1QC+TAMs细胞两种细胞分类,既往应用M1和M2型的TAMs细胞分类方法则存在一定的局限性。此外,C1QC+TAMs细胞亚群丰度是HCC患者预后的独立危险因素。2.HCC患者的调节性DCs细胞具有迁移,激活和免疫调节特性。3.C1QC+TAMs细胞,调节性DCs细胞,Treg细胞和耗竭性CD8+T细胞之间存在强烈的细胞共抑制,共刺激,趋化和粘附相互作用,进而形成免疫抑制生态位。4.基于转录组,RTKs表达和CNV模式三个维度分析,显示HCC肿瘤细胞呈现瘤内外异质性。5.TIGIT-PVR/PVRL2轴在HCC肿瘤浸润免疫细胞和APCs细胞之间提供显著的共抑制信号,未来可成为潜在的HCC免疫治疗的新靶点。