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传统发酵食品selleck LGK-974中微生物群落复杂，代谢途径多样，其中具有脱羧酶活性的微生物可代谢游离氨基酸形成潜在的危害因子—生物胺(biogenic amines,BAs)。BAs是一类具有生理活性的低分子碱性含氮化合物，主要由氨基酸脱羧酶脱羧产生。BAs根据其含https://www.selleck.cn/products/MK-2206.html氨量可分为单胺、二胺和多胺，根据其化学结构又可分为脂肪类胺、芳香类胺和杂环类胺，其主要形成途径包括微生物脱羧作用以及醛、酮氨基化和转胺作用。传统发酵食品中含有脱羧酶活性的乳酸菌、假单胞菌和肠杆菌等微生物是主要产胺菌。少量的BAs可以调节人体正常生理功能，但摄入过多则会导致中毒，甚至死亡。因此，传统发酵食品中的BAs问题一直备受关immune cell clusters注。解析微生物多样性与BAs形成之间的关系，有利于探明发酵食品中BAs形成途径和机制，可以有效控制BAs的产生与积累，以期为提高传统发酵食品安全性及品质提供参考，保证食品安全。本文重点综述了发酵蔬菜、发酵豆制品、发酵乳制品、发酵肉制品以及发酵水产品等传统发酵食品中微生物多样性与BAs形成之间的相关性，明确了各种发酵食品中的主要产胺菌株，解析BAs形成机制，以期为提高传统发酵食品安全性及品质提供参考。

目的：分析子宫内膜癌患者超声血流参数和肿瘤病理分期及预后相关性。方法：选择2018年1月—2019年12月在天津第五中心医院生态城医院以及天津港口医院就诊治疗的子宫内膜癌患者60例以及同时间段在以上医院就诊治疗的子宫内膜增生患者60例的数据资料进行回顾性分析。对比子宫内膜癌和子宫内膜增生患者的超声检查常规特征情况、超声血流参数情况[血流阻力指数(RI)、搏动指数(PI)、收缩期峰值流速(PSV)]。对比不同biocomposite ink宫颈癌国际妇产科联盟(FIGO)分期的子宫内膜癌患者的超声血流参数情况。对比不同预后的子宫内膜癌患者的超声血流参数情况。分析不同超声血流参数对子宫内膜癌患者预后的预测情况。结果：子宫内膜癌组患者的子宫内膜增厚程度、血流信号比例以及内膜回声不均匀比例均高于子PUN30119宫内膜增生组患者(均P<0.05)。子宫内膜癌组患者的PI、RI均低于子宫内膜增生组患者，PSV高于子宫内膜增生组患者(均P<0.05)。不同FIGO分期的子宫内膜癌患者PI、RI、PSV水平比较差异有统计学selleck意义(均P<0.05)。随访3年，子宫内膜癌患者死亡14例，死亡患者的PI、RI均低于子宫内膜增生患者，PSV高于存活患者(均P<0.05)。利用PI、RI、PSV对于子宫内膜癌患者的预后进行预测，最佳截断值分别为0.47、0.35、44.86cm/s,约登指数分别为61.80%、62.42%、67.39%。结论：子宫内膜癌患者的部分超声血流参数和肿瘤的病理分期与预后具有关联性，利用部分超声血流参数对患者的预后进行推测具有一定价值。

背景及目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤,2020年,结直肠癌发病率Puromycin为10.0%,约193万例,是全球癌症相关死亡率的第二大原因。临床上5-FU是治疗结直肠癌患者的一线化疗药物,据调查统计:结直肠癌患者长期使用含5-FU辅助化疗药物后,约50%的晚期患者对5-FU及其代谢物耐药。5-FU发挥抗癌作用的疗效仅有10%-17%,细胞内5-FU暴露浓度降低是造成疗效下降且肿瘤细胞获得化学抗性的原因之一。因此,需开发多种联合治疗方案,提高其治疗效果并降低其毒性。基于课题组前期文献调研,五味子乙素与抗肿瘤药物联用,具有增效减毒的作用。本课题研究五味子乙素增加5-FU在结直肠癌细胞内的暴露水平,协同5-FU抗结直肠癌作用的机制。方法:首先,采用CCK-8实验考察5-FU、五味子乙素及两药联用对结直肠癌细胞系(Caco-2、HT-29、SW480)、原代结直肠癌细胞增殖的影响;Tunel细胞凋亡实验研究5-FU、五味子乙素及两药联用对HCT116细胞凋亡的影响。其次,为研究五味子乙素增加5-FU在结直肠癌细胞内的暴露水平。采用Bioelectricity generationRT-PCR实验研究五味子乙素对ABC家族外排转运体的影响;采用非靶向代谢组学实验定量五味子乙素处理的HCT116细胞内代谢小分子及ABC外排转运体内源性底物变化;采用Western blot实验验证五味子乙素对ABC外排转运体表达的影响。进一步研究五味子乙素对ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体的影响,采用腺病毒转染实验使ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白高表达;Western blot实验研究五味子乙素对过表达ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白的影响、CCK-8实验考察五味子乙素联合5-FU对过表达ABCC5和ABCC11细胞增殖的影响及过表达ABCC5和ABCC11细胞内5-FU的浓度变化。然后,建立并验证一种直接、灵敏、有效的LC-MS/MS测定HCT116细胞内五味子乙素浓度检测方法,探讨五味子乙素在细胞中的浓度空间分布。前处理方法:经样品/含内标的甲醇(1:3)沉淀蛋白后进样分析。色谱条件:Atlantis(?)T3-C18色谱柱(2.1*100 mm,3μm);流动相:水(含0.2%甲酸)-甲醇,梯度洗脱程序为:0 min,0%B;0-0.5 min,0%-90%B;0.51-53 min,100%B。流速为0.4 m L/min,进样量为5μL。质谱条件:ESI离子源,正离子模式下进行检测,多反应监测模式(MRM)。最后,采用转录组学实验研究五味子乙素抑制结直肠癌细胞ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体靶点的探索,研究Sch.B抑制ABC转运体的分子机制。结果:首先,CCK-8实验结果发现,与对照组或单独给药组相比,五味子乙素联用5-FU显著抑制结直肠癌细胞系(Caco-2、HT-29、SW480)和原代结直肠癌细胞的增殖;Tunel细胞凋亡实验结果表明了五味子乙素增强了5-FU促进HCT116细胞凋亡的作用Galunisertib半抑制浓度。其次,通过研究五味子乙素增加5-FU在结直肠癌细胞内的暴露水平,RT-PCR实验结果发现五味子乙素抑制ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白mRNA的表达;非靶向代谢组学结果发现五味子乙素抑制ABCC11蛋白的表达,进而抑制白三烯代谢物的外排,使白三烯代谢物在胞内的蓄积;进一步研究五味子乙素对ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体的影响,RT-PCR和Western blot实验结果验证ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白的高表达;CCK-8实验发现5-FU合用五味子乙素可抑制表达ABCC5和ABCC11细胞的增殖;LC-MS/MS定量细胞内5-FU浓度水平结果显示,五味子乙素抑制ABCC11的表达,使胞内5-FU浓度蓄积。然后,针对LC-MS/MS建立的五味子乙素测定方法结果表明,五味子乙素在20-1000 ng/m L范围内线性关系良好,方法学验证都符合要求。最后,转录组实验结果发现在Sch.B药物处理后,分别有ABCC2、ABCC5和ABCC11等20个基因和CCN2、PLPPR3等26个基因显著下调和上调;GO富集分析显示谷胱甘肽跨膜转运和白三烯B4代谢过程被显著抑制且下调;对差异表达基因进行GO level2和KEGG通路富集显示:差异表达的基因在转运体通路中被富集且转运体的活性被显著抑制。结论:5-FU联合五味子乙素可显著抑制结直肠癌细胞系(Caco-2、HT-29、SW480)和原代结直肠癌细胞的增殖并且促进凋亡。其次,研究五味子乙素增加5-FU在结直肠癌细胞内的暴露水平结果表明五味子乙素显著抑制ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白mRNA的表达,五味子乙素抑制ABCC11蛋白的外排作用,使其特异性的内源性底物白三烯代谢物外排作用减弱,造成胞内白三烯代谢物蓄积。进一步研究五味子乙素对ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体的影响发现五味子乙素显著抑制ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白的高表达,抑制ABCC5和ABCC11蛋白表达增强5-FU抑制HCT116细胞的增殖及抑制5-FU药物流出细胞,提高其在细胞内的暴露浓度,增强抗结直肠癌作用。然后,建立了一种简便、快速、灵敏的UHPLC-MS/MS测定细胞中五味子乙素浓度的方法。发现五味子乙素在细胞核的空间分布表现时间上的差异,这可能有助于研究Sch.B对癌细胞的作用。最后,通过转录组学实验研究五味子乙素抑制结直肠癌细胞ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体靶点的探索结果表明HCT116细胞内共有260和73个基因被上调和下调。Sch.B处理后,分别有20和26个差异表达基因被显著下调和上调;Sch.B通过抑制转运体通路的活性,抑制ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体的功能,抑制其介导谷胱甘肽跨膜转运和白三烯B4代谢过程。

目的 探讨甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)在胶质瘤患者中的表达，及其与临床病理特征和预后的相关性。方VP-16生产商法 纳入癌症基因组图谱(TCGA)数据库中胶质瘤的数据和GTEx数据集中正常脑组织数据，分析MeCP2基因在胶质瘤和正常脑组织的表达差异，分析MeCP2水平与胶质瘤患者临床病理特征和预后的相关性；采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析影响患者预后的相关因素，通过差异表达基因进Autoimmune recurrence行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，探讨MeCP2参与调控的分子信号通路，应用CIBERSORT数据库进行肿瘤免疫细胞浸润分析。结果 MeCP2在胶质瘤中的表达高于正常脑组织，MeCP2表达水平随胶质瘤病理分级升高而降低，MeCP2高表达水平AMG510试剂与低龄(≤60岁)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变型和1p/19q共缺失均相关(P<0.001或P<0.01)。生存分析显示，MeCP2低表达的患者预后较差(P<0.001)。多因素Cox回归分析显示，年龄、WHO分级和IDH突变型是胶质瘤患者生存的独立影响因素，但MeCP2表达水平不是。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析显示，MeCP2相关的差异表达基因在细胞因子和趋化因子信号通路显著富集。肿瘤免疫细胞浸润分析表明，MeCP2低表达组有更多的免疫细胞浸润和更高的免疫评分。结论 MeCP2参与调控细胞因子或趋化因子信号通路，并且与免疫细胞浸润密切相关。

目的 通过蛋白质组学方法探讨消癌解毒方促进肝癌小鼠肿瘤细胞铁死亡,抑制移植瘤生长的作用机制。方法 C57BL/6J小鼠随机分为模型组、消癌解毒方低剂量组、消癌DS-3201作用解毒方高剂量组、消癌解毒方联合铁死亡抑制剂组、铁死selleck化学亡抑制剂组、顺铂组。构建H22小鼠移植瘤模型,消癌解毒方低、高剂量组予消癌解毒方灌胃,剂量分别为(10、20 g·kg~(-1)·d~(-1));铁死亡抑制剂组予Liproxstatin-1腹腔注射,剂量为10 mg·kg~(-1)·d~(-1);顺铂组予顺铂腹腔注射,剂量为10 mg·kg~(-1)·d~(-1);消癌解毒方联合铁死亡抑制剂组予消癌解毒方(20 g·kg~(-1)infectious period·d~(-1))灌胃以及Liproxstatin-1(10 mg·kg~(-1)·d~(-1))腹腔注射,模型组灌胃等量生理盐水。连续给药11 d后剥取瘤体计算抑瘤率;HE染色检测病理变化;透射电镜观察线粒体结构变化;流式细胞术检测瘤体组织活性氧(ROS)水平;制备血清以TMT肽段标记结合LC-MS/MS寻找差异蛋白表达谱、应用IPA软件进行分析;生化检测血清铁离子、还原型谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量;Western blot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HMOX1)、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的蛋白表达水平。结果 消癌解毒方低、高剂量及顺铂能抑制瘤体生长,抑瘤率分别为36.12%、51.63%、57.43%,铁死亡抑制剂促进了瘤体的生长,抑瘤率为-45.56%,消癌解毒方联合铁死亡抑制剂组瘤体较铁死亡抑制剂组缩小,抑瘤率为18.11%;HE染色显示消癌解毒方高剂量组、顺铂组瘤体组织出现凋亡细胞及大量空泡蓄积;透射电镜结果显示,消癌解毒方低、高剂量组出现一定程度的线粒体萎缩及膜密度增加;流式结果显示:消癌解毒方干预后ROS水平明显升高(P<0.01);蛋白质组学检测显示,消癌解毒方高剂量组与模型组相比差异蛋白共129个,其中下调蛋白62个,上调蛋白67个,差异表达涉及脂质代谢等方面;生化检测结果显示,消癌解毒方干预可升高小鼠血清铁离子、MDA含量,降低GSH含量;Western blot结果显示,消癌解毒方高剂量组干预后Nrf2、HMOX1蛋白表达水平增高,SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低(P<0.01)。结论 消癌解毒方可调控Nrf2/HMOX1信号通路,调节氧化应激,升高脂质过氧化水平,促进肝癌细胞铁死亡,可能是其抑制移植瘤生长的作用机制之一。

目的 通过整理夏荔芪胶囊治疗前列腺增生(本虚标Chinese herb medicines实证)的研究文献，对其进行临床综合评价，明确其优势和特点及临床精准定位，为决策部门提供参考。方法 采用定性与定量相结合的评价方法，从安全性、有效性、经济性、创新性、适宜性、可及性、中医药特色的“6+1”维度构建评价体系，通过专家对准则层、指标层赋予权重，运用多准则决策分析模型、SCH772984中成药临床证据和价值评估软件对各维度进行计算后进一步转化为A～D4个等级。结果 基于现有研究，(1)夏荔芪胶囊说明书对不良反应的说明、国家药品不良反应监测中心自发呈报系统、临床安全性系统评价与Meta分析等多源数据表明，该药品不良反应主要有胃部不适、腹胀、腹泻等，未观察到严重不良反应。风险可控，安全性好，安全性评为A级。(2)临床有效性系统评价与Meta分析表明，夏荔芪胶囊单用或联合常规治疗后，对国际前列腺评分、最大尿流率等的改善均优于对照组或单用常规治疗组。有效性较好，临床意义较大，有效性评为B级。(3FUT-175体内实验剂量)对夏荔芪胶囊联合常规治疗vs常规治疗进行成本-效果分析，说明其相对经济性。证据报告比较充分、结果较明确，经济性评为B级。(4)夏荔芪胶囊自2004年起先后获得8项国家专利，在临床创新性、服务体系创新性及产业创新性方面均可体现企业的创新性。创新性好，评为A级。(5)基于问卷调查结果，夏荔芪胶囊可基本满足临床用药需求。适宜性较好，评为B级。(6)从药品价格水平、可获得性和可负担性3方面得出夏荔芪胶囊可及性较好，评为B级。(7)夏荔芪胶囊是在络病理论的基础上化裁自李东垣的“通关丸”。中医药特色较突出，评为B级。综合“6+1”维度证据评价结果，夏荔芪胶囊治疗前列腺增生(本虚标实证)的临床价值综合评为B类。结论 夏荔芪胶囊治疗前列腺增生(本虚标实证)临床价值较好，创新性较为突出，据国家卫生健康委员会发布的《药品临床综合评价管理指南(2021年版试行)》，建议可按程序转化为基本临床用药管理的相关政策结果。

目的 研究肝素酶修饰的血栓弹力图(hmTEG)用于连续性肾脏替代治疗(CRRT)时肝素监测的临床价值。方法 选取2014年1月至2019年6月解放军第九〇八医院重症医学科进行血液净化治疗时用DS-3201研究购买肝素抗凝的97例患者，总血液净化台次为278,依据血液净化抗凝时采用部分活化凝血酶原时间(APTT)监测或hmTEG监测，将患者分为APTT组和TEG组，比较两组患者血液净化前及第28天SOFA、血液净化总时间、肝素总剂量、滤器寿命与出血并发症情况，并进行生存分析。结果 与APTT组相比，TEG组的肝素总剂量明显增加、血液净化时间和平均滤器寿命明显延长(P<0.05);与APTT组的第28Baricitinib使用方法天SOFA相比，TEG组的SOFA明显更低(P<0.05);生存分析显示，APTT组患者的28天死亡风险是TEG组的2.01倍(P<0genetic enhancer elements.05),TEG组的72 h滤器寿命较APTT组明显长(P<0.05)。结论 用hmTEG监测血液净化时的肝素抗凝更安全且可以延长滤器使用寿命，改善病情及病死率。

近视是会引起视觉功能障碍甚至致盲的全球性公共卫生问题,受遗传和环境因素共同影响。既往基于高度近视家系等遗传学方面研究发现低密度脂蛋白受体相关蛋白的伴侣蛋白 1(low-density lipoprotein receptor-related protein-associated protein BI 10773临床试验1,LRPAP1)基因和高度近视有关,但仍缺乏基础研究证实。另外,户外光照时间和光照强medullary rim sign度是影响近视患病率的重要环境因素。然而,光照不足导致近视的机制仍未阐明。本课题分别从遗传和环境角度出发,旨在初步探讨lrpap1基因和弱光环境对斑马鱼近视调节的作用及其机MK-1775制,为近视防控发掘潜在的治疗靶点。一方面,通过构建lrpap1基因纯合移码突变突变(c.264_268delinsTCTC,p.Lys35Asnfs*3)斑马鱼模型,探索其基因功能缺失对近视的影响及其机制。结果发现,lrpap1基因纯合移码突变导致斑马鱼出现进行性近视表型。另外,转录组测序和生物信息学分析(KEGG、GO、GSEA)提示细胞凋亡相关通路富集,我们通过吖啶橙染色和TUNEL染色证明lrpap1基因纯合移码突变斑马鱼眼球细胞凋亡增加。最后,免疫印迹试验(Western Blot)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)激动剂/抑制剂胚胎孵育实验表明突变体眼球TGF-β水平升高(P<0.05)并且TGF-β激动剂处理野生型胚胎可加重眼球凋亡程度而使用TGF-β抑制剂可以减轻突变体胚胎的凋亡,表明lrpap1基因纯合移码突变通过TGF-β诱发的细胞凋亡过程参与近视的调控。另一方面,从环境因素出发,探索弱光环境(<51ux)对斑马鱼近视的影响。屈光相关参数测量结果表明弱光干预组斑马鱼在受精后7、14、21和28天相对屈光度向近视漂移(P<0.05),受精后21和28天时眼轴/身长增大(P<0.05),转录组测序结果表明光传导通路富集(KEGG分析)并且弱光干预组受影响部位主要富集于感光细胞外段并涉及眼睛发育、视觉系统发育等生物学过程(GO分析)。HE染色和免疫荧光分析显示,视杆细胞外段延长,视紫红质(Rhodopsin,RHO)表达增加伴脉络膜变薄。同时,斑马鱼胚胎过表达RHO结果表明RHO基因过表达导致幼鱼相对屈光度向近视漂移(P<0.05)并且诱发巩膜层扩张表现,而外层视网膜有4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)累积。此外,弱光干预组眼球活性氧(P<0.05)和丙二醛(P<0.05)水平升高,视网膜有脂褐素和4-HNE累积且TUNEL阳性细胞明显增多(P<0.05)。最后,4-HNE刺激人源视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞实验表明低浓度(20μM)4-HNE提高细胞增殖能力和TGF-β转录水平(P<0.05),高浓度(40μM)时表现为抑制细胞增殖并诱发细胞凋亡和铁死亡。以上结果提示RHO通过脂质过氧化产物4-HNE影响视网膜色素上皮细胞功能,从而介导近视的发生。

卵巢畸胎瘤(ovarian teratoma,OT)是最常见的女性生殖细胞肿瘤(ovarian germ cell tumors,OGCTs),其中成熟性畸胎瘤占95%,未成熟畸胎瘤占1%～3%。卵巢畸胎瘤,尤其是未成熟畸胎瘤主要见于30岁以下年轻女性及幼女,手术、化疗以及疾病复发等过程均可能对女性内分泌、生殖能力造成损害,进而给患者及其家庭带来了不可忽视的精神压力和经济负担。尽管有研究认为卵巢畸胎瘤的发病与卵母细胞孤雌激活和减数分裂异常以及卵母细胞与颗粒细胞发育协调性失衡有关,但该病的确切病因仍旧未知。近年来有研究发现在既往有卵巢畸胎瘤病史的家族中女性成熟性畸胎瘤患病率更高,从而认为其发病可能与遗传有关;在小鼠卵巢畸胎瘤模型的研究中也发现畸胎瘤的形成与多种基因的突变有关。但目前针对人类卵巢畸胎瘤遗传背景的相关研究极少,寻找该病的遗传易感基因有助于进一步了解该类疾病的病因学,并对预防及临床治疗提供重要的理论基础。本课题组在前期研究中收集到1个含2名患病成员的卵巢未成熟畸胎瘤家系。为寻找其可疑致病基因我们采用全外显子测序筛选联合SangAntimicrobial biopolymerser测序验证的方法先后在该家系中筛选并发现2个胚系突变——父源性骨形态发生蛋白15(Bone Morphogenetic Protein 15,BMP15)p.R88C错义突变和母源性钙黏蛋白相关家族成员2(Cadherin Related Family Member2,CDHR2)p.R745X无义突变——可能与家族中女性未成熟畸胎瘤的发病相关。课题组前期的研究显示BMP15基因胚系p.R88C错义突变导致其成熟蛋白分泌水平明显降低,在小鼠模型中突变可以诱导雌鼠卵母细胞孤雌激活,从而导致部分雌鼠卵巢畸胎瘤的发生。但在家系中我们发现携带BMP15p.R88C错义突变的女性并非全部发病,与家庭中未发病的女性携带者相比,两个未成熟畸胎瘤患者同时携带CDHR2基因胚系的p.R745X无义突变。CDHR2属原钙黏蛋白家族,高表达于肝脏、肾脏、结肠中,而在以上组织来源的肿瘤中低表达,在结肠癌及肝癌细胞中过表达CDHR2均可抑制肿瘤细胞的增殖。迄今为止,CDHR2及其特异性突变p.R745X与肿瘤的关系尚不清楚。本研究旨在前期研究基础上进一步探索家系中CDHR2 p.R745X与卵巢未成熟畸胎瘤的发病关系,为后续卵巢未成熟畸胎瘤的分子遗传学机制研究提供基础。拟通过以下三个步骤研究CDHR2 p.R745X无义突变的致病性及其与卵巢未成熟畸胎瘤的发病关系:(1)完善家系成员CDHR2 p.R745X的突变检测,明确系谱情况;依据美国遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)ZD1839分子式基因突变解读指南评估该变异的致病性。(2)明确CDHR2 p.R745X突变在蛋白表达水平及细胞内定位的改变情况;(3)通过基因编辑技术构建与人CDHR2 p.R745X突变相一致小鼠模型,与前期实验构建的BMP15 p.R86C点突变小鼠杂交形成CDHR2~(+/Q744X) BMP15~(+/R86C)双基因突变杂合鼠,观察雌鼠卵巢组织学改变情况,探讨CDHR2 p.R745X突变与卵巢未成熟畸胎瘤的发病关系。第一部分CDHR2 p.R745X在卵巢未成熟畸胎瘤家系的系谱研究及致病性评价目的:在家系中进行CDHR2 p.R745X突变的Sanger测序验证和系谱研究,完成该家系图谱的绘制和变异位点的致病性评价。方法:1.严格遵循相关医学伦理学要求,收集未成熟畸胎瘤家系先证者及家系其他成员静脉血,提取DNA。2.将家系成员DNA行Sanger测序,验证突变的真实性并明确变异位点与临床表型的关系及家系其他成员的携带情况,绘制系谱图。3.完成突变位点与疾病表型的共分离分析;查询Gnom AD、Ex AC、TOPMed、Gnom AD＿exome等有公信力的人群数据库以及Clinvar、db SNP和COSMIC等疾病相关数据库了解变异位点的最小等位基因频率、变异位点与疾病相关的信息登记情况;采用Mutation Taster、Combined Annotation Dependent Depletion(CADD)等在线数据库预测突变后蛋白结构及功能改变情况。4.依据ACMG基因突变解读指南综合评价CDHR2 p.R745X的致病性。结果:1.全外显子测序结果提示该家系中卵巢未成熟畸胎瘤患者均同时携带BMP15 p.R88C(CGC to TGC)错义突变和CDHR2 p.R745X(CG A to TGA)无义突变;一代测序证实了以上突变的真实性,且BMP15 p.R88C为父系来源,CDHR2 p.R745X为母系来源。该家系中单独携带以上任何一个突变者均未发病;同时携带以上突变的个体均发病。2.CDHR2 p.R745X突变与家系中卵巢未成熟畸胎瘤发病具备共分离特性;人群数据库Gnom AD、Ex AC、TOPMed、Gnom AD＿exome中显示最小等位基因频率普遍低频(最低0.000060,最高0.000108),与疾病相关的人类基因组变异数据库Clinvar中暂无该位点突变所致疾病的登记信息,而COSMIC数据库中显示该突变位点在对前列腺癌和胰腺癌的外显子测序中有发现,但无进一步研究;Mutation Taster、CADD在线数据库预测提示CDHR2 p.R745X为有害突变。3.依据ACMG基因突变解读指南综合评价CDHR2 p.R745X突变符合1个极强致病性证据、2个中等致病性证据和2个支持性致病证据,因此判定该位点的突变为“致病性突变”。结论:1.该卵巢未成熟畸胎瘤家系中存在父系来源的BMP15 p.R88C错义突变和母系来源的CDHR2 p.R745X无义突变2个胚系基因变异位点,同时携带以上胚系突变的个体均发病,推测卵巢未成熟畸胎瘤可能为多基因遗传病,为进一步寻找该病的遗传易感基因提供了重要的实验依据。2.依据ACMG基因突变解读指南评价CDHR2 p.R745X为致病性突变,推测该突变可能与家系卵巢未成熟畸胎瘤发病有关。可通过体外细胞实验验证突变对蛋白表达及亚定位的影响,来进一步验证该位点的致病性。第二部分CDHR2 p.R745X突变后蛋白表达水平及细胞亚定位的研究目的:了解CDHR2 p.R745X突变蛋白表达水平改变情况及其突变产物在细胞中的定位情况。方法:1.构建野生型和突变型CDHR2质粒,瞬时转染HEK-293T细胞。2.检测细胞转染效率合格后,分析野生型质粒组和突变型质粒组细胞CDHR2 m RNA表达差异;采用Western blot方法检测野生型质粒组和突变型质粒组细胞CDHR2蛋白水平变化。3.采用激光共聚焦成像检测野生型CDHR2和CDHR2 p.R745X突变产物在HEK-293T细胞中的定位改变。结果:1.CDHNaporafenib抑制剂R2 p.R745X突变型质粒组CDHR2 m RNA和蛋白水平均明显低于野生型质粒组,二者差异均有统计学意义(P<0.05)。2.野生型CDHR2蛋白分布于细胞膜,突变后表达产物绝大部分位于细胞质。结论:体外实验证明CDHR2 p.R745X突变改变蛋白表达和亚细胞定位,进一步证明该位点具有致病性。该突变与卵巢未成熟畸胎瘤的发病是否相关可通过动物体内实验进一步研究。第三部分CDHR2 p.R745X与卵巢未成熟畸胎瘤发病关系的体内实验研究目的:通过模拟家系致病突变携带情况,构建双基因突变杂合小鼠,观察CDHR2 p.R745X突变是否与BMP15 p.R88C突变共同导致了卵巢未成熟畸胎瘤表型,以探讨CDHR2 p.R745X与卵巢未成熟畸胎瘤发病关系。方法:1.采用CRISPR/Cas9技术构建以C57BL/6J为遗传背景的CDHR2p.Q744X基因突变模型鼠,获取CDHR2~(+/Q744X)点突变小鼠。2.与课题组前期构建的相同遗传背景的C57BL/6J BMP15~(R86C/R86C)点突变鼠杂交获得双基因突变杂合雌鼠CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)作为实验组(Mutation),野生型C57BL/6J CDHR2~(+/+)BMP15~(+/+)雌鼠作为实验对照组(Wild type)。3.取2月、4月、6月三个时间点的CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)双基因突变杂合雌鼠及同月龄对照组小鼠卵巢,观察对比二者外观形态及HE染色的石蜡切片中卵巢的组织学改变。结果:1.成功构建了CDHR2~(+/Q744X)基因编辑小鼠模型;并在建系过程中获取了CDHR2~(+/Q744X)杂合突变小鼠、CDHR2~(Q744X/Q744X)纯合突变小鼠和与BMP15~(R86C/R86C)杂交后形成的双基因突变鼠CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)。2.4月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)雌鼠卵巢体积较野生型雌鼠卵巢体积增大,差异有统计学意义(P<0.05)。2月龄和6月龄实验组与对照组卵巢体积无明显差异(P>0.05)。2月龄、4月龄、6月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)与CDHR2~(+/+)BMP15~(+/+)雌鼠苏木精-伊红(HE)染色切片镜下均未见神经管、神经上皮、软骨、皮脂腺、毛囊等畸胎瘤中常见肿瘤组织。仅6月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)雌鼠卵巢石蜡切片HE染色镜下可见1例滤泡囊肿(1/20)。3.4月、6月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)雌鼠与对照组相比卵巢内部结构混乱,各阶段生长卵泡数目明显减少,闭锁卵泡数目明显增多,部分卵泡丧失正常形态,可见双核卵母细胞(4月龄小鼠更突出)。结论:在模拟卵巢未成熟畸胎瘤家系构建和培育的CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)小鼠模型中,4月、6月龄雌鼠卵巢可见异常卵泡(4月龄明显),且4月龄雌鼠卵巢体积大于同月龄野生型雌鼠卵巢,HE切片镜下可见含形态异常卵泡,但实验组所有月龄雌鼠卵巢均未见畸胎瘤所特有的三胚层结构。CDHR2 p.R745X及BMP15p.R88C在小鼠模型中未形成卵巢畸胎瘤表型可能与小鼠模型的局限性、更多遗传易感基因和/或致病基因的参与以及基因的突变负荷等因素有关,可在未来研究中进一步探索。综上所述,本研究以卵巢未成熟畸胎瘤家系的测序结果为研究起点,依据文献结论及该家系测序发现的父源性BMP15 p.R88C错义突变和母源性CDHR2 p.745X无义突变,推测卵巢未成熟畸胎瘤可能为多基因遗传病。在前期BMP15 p.R88C体内体外研究的基础上,首先对新发现的母源CDHR2 p.745X无义突变的致病性进行了评估和体外实验验证,随后通过模拟家系构建CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)双基因突变杂合小鼠模型,观察卵巢未成熟畸胎瘤表型的形成情况,验证BMP15 p.R88C突变和CDHR2p.745X突变共同导致卵巢未成熟畸胎瘤发病的研究假设。研究发现:(1)该家系携带父系来源的BMP15 p.R88C和母系来源的CDHR2 p.R745X两个特异突变。前者的致病性前期研究已经证实,后者依据ACMG发布的基因突变指南评估为致病性突变。以上发现支持卵巢未成熟畸胎瘤的分子遗传学机制可能与多基因联合致病有关的假设。(2)体外实验证实CDHR2p.R745X突变可以降低CDHR2的蛋白表达水平,其突变产物由细胞膜转变为细胞质定位,验证了该突变导致蛋白损伤的突变效应(证据等级中的PVS1)。(3)体内实验发现各月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)雌鼠卵巢中均未见向外胚层、中胚层或内胚层分化的肿瘤样组织,但4月龄、6月龄雌鼠卵巢中均可见异常发育的卵泡(4月龄显著)。本研究虽然在小鼠模型中未见卵巢未成熟畸胎瘤表型形成,但为后续研究提供了以下几点启示:(1)人与小鼠之间存在的种属差异可能是导致实验中基因编辑模型鼠不能再现卵巢未成熟畸胎瘤表型的原因之一。(2)该家族性卵巢未成熟畸胎瘤的发病除以上基因突变外,还可能存在其他遗传易感基因,有待进一步探索。(3)进一步研究还需要深入考虑其他因素,如:更多遗传易感基因的参与;遗传背景不同,基因所起促癌或抑癌作用可能与差别;肿瘤负荷对研究结果的影响等。

利用UHPLC-TOF-MS技术分析交泰丸在正常大鼠体内入血成分Enfermedad por coronavirus 19，通过网络药理学和动物实验研究交泰丸治疗抑郁症的作用机制。利用UHPLC-TOF-MS技术检测此网站大鼠灌胃交泰丸后的入血成分，结合DisGeNET、SwissTargetPrediction等数据库筛选抑郁症与交泰丸入血成分的交集靶点，构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）网络。将关键靶点导入DAVID平台进行基因本体论（Gene Ontology， G寻找更多O）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路注释，结合成分、靶点和通路，利用Cytoscape 3.9.1软件构建“成分-靶点-通路”网络，预测交泰丸治疗抑郁症的关键靶点及通路。建立大鼠慢性不可预知性温和应激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）抑郁模型，进行行为学实验，ELISA法检测大鼠血清炎症因子和脑内神经递质水平，蛋白免疫印迹（Western blot）法检测大鼠海马组织中关键靶点表达。结果鉴定出交泰丸在正常大鼠体内入血成分共17个，10个为生物碱类化合物。入血成分与疾病共有交集靶点124个，根据PPI网络结果筛选出核心靶点52个，其中包括NLRP3和caspase-1等，KEGG富集结果显示主要涉及NOD样受体通路等15条典型通路。动物实验研究结果显示，交泰丸可显著改善CUMS抑郁模型大鼠的抑郁样行为，提高脑内神经递质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）、多巴胺（dopamine， DA）及去甲肾上腺素（norepinephrine， NE）的水平，降低血清白细胞介素-1β（interlenkin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白细胞介素-6（interlenkin-6，IL-6）水平，下调海马区NLRP3和caspase-1蛋白表达水平，抑制NLRP3介导的NOD样受体信号通路。综上所述，交泰丸可能通过抑制NLRP3炎症小体，抑制NLRP3介导的NOD样受体通路，发挥抗抑郁的作用。