DuDu365文献分享天地

鹅绒藤（Cynanchum chinense）是一种传统中药，为明确造成鹅绒藤叶片花叶症状的原因，本研究采用小RNA深度测序技术结合RT-PCR的方法鉴定引起山西太谷鹅绒藤病毒花叶症状的病原，并通过生物信息学的手段对病毒序列进行分析。结果表明，鹅绒藤样品经小RNoninfectious uveitisNA深度测序技术共获得15 039 334个原始序列，将拼接contigs与NCBI中的病毒数据库进行比对注释，结果显示为苜蓿花叶病毒（AMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）。利用特异引物克隆了AMV和CMV的外壳蛋白（CP）和移动蛋白（MP）基因全序列，分别命名为AMV-BR和CMV-BR。通过序列比对分析，发现AMV-BR CP氨基酸序列和核苷酸序列与AMV分离物AMV-Gyn（MH332899）、Dich-rep（MW835989）和VIC-320（MF075254）的相似性均达到100%；MP氨基酸序列和核苷酸序列与AMV分离物AMV-Gyn（MH332899）的相似性最高，均为99.3％。CMV-BR CP氨基酸序列和核苷酸序列分别与CMV亚组ⅠA中CMV分离物YA17（MH119159）的相似性最高，分别为100％和99.1％；MP氨基酸序列和核苷酸序列与CMV亚组Ⅰ分离物PVZ-IETD-FMK半抑制浓度-0185（ON013887）的相似性最高，selleck产品分别为98.2％和96.4％。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明，CMV-BR属于CMV亚组Ⅰ中的成员。这是首次在山西鹅绒藤上检测到AMV和CMV，该研究有助于深入了解AMV、CMV的分子进化，也为鹅绒藤病毒病的防治提供一定的理论依据。

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种死体营养型植物病原真菌,寄主范围广泛,可侵染大豆、花生、油菜等油料作物及药用植物、蔬菜、花卉在内的600余种植物,所引起的菌核病分布广、危害重,造成极大经济损失。核盘菌属于多型菌态(Polymorphism)的植物病原真菌,在其生活史及侵染循环过程中形成菌核,侵染垫,子囊盘和子囊孢子等多种形态。其中,菌核是核盘菌无性生殖和有性生殖相互转换的重要结构,在其生长发育及致病过程中发挥重要作用。菌核形成受到复杂信号途径的精细调控Rapamycin采购,因此,进一步探究菌核的形成与调控机制,有助于解析核盘菌生长发育与致病的关键环节,为有效防控菌核病提供理论依据。细胞自噬(Autophagy)是真核生物对细胞内物质进行降解和周转的生物过程。研究表明,细胞自噬在植物病原真菌生长发育和侵染致病等方面起重要作用,但其生物学功能尚未在核盘菌中得到解析。因此,本研究利用遗传学、分子生物学以及生物化学等多种手段探究了细胞自噬蛋白激酶SsAtg1及其互作蛋白对核盘菌自噬发生、菌核发育、侵染垫形成及致病力的调控机制,解析了核盘菌TOR(Target of rapamycin)信号途径和PP2C磷酸酶(Type 2C protein phosphatases)SsPtc3与细胞自噬的关联,研究结果如下:1.自噬相关基因SsATG1调控自噬发生,影响核盘菌菌核形成和致病力。自噬途径由自噬相关基因(Au Topha Gy-related genes,ATGs)分级调控,Atg1复合物是参与自噬起始的最上游组分。在菌丝与菌核的比较转录组中,发现SsATG1在菌核阶段表达量显著上升。利用Split-marker方法对SsATG1基因靶向敲除后,在MDC(Dansylcadaverine)染色和蛋白质免疫印迹中发现ΔSsatg1的细胞自噬途径被阻断。SsATG1参与核盘菌营养和氧化胁迫的响应,并且ΔSsatg1无法形成菌核,菌核发育相关基因SsPAC1,SsSCD1和SsTHR1的表达量均显著低于野生型。致病力分析表明,ΔSsatg1侵染垫的发育水平和穿透能力降低致使其在不同寄主上的致病力明显减弱。综上所述,SsATG1是核盘菌调控细胞自噬途径的核心基因,在核盘菌胁迫响应、菌核形成、侵染垫发育和致病力等方面均发挥重要作用,研究结果为深入解析核盘菌中细胞自噬的生物学功能及调控机制提供理论基础。2.SsPtc3与SsAtg1互作,介导核盘菌胁迫响应与致病力。SsAtg1是自噬相关蛋白中唯一的蛋白激酶,在胁迫响应中具有重要作用。为揭示SsAtg1响应胁迫影响核盘菌生长发育及致病的作用机制,以SsAtg1为诱饵蛋白,利用酵母双杂交筛选核盘菌c DNA文库,获得与SsAtg1互作候选蛋白10个,包括SsPtc3、SsAtg13和SsPho85等。SsPtc3属于PP2C磷酸酶,是响应外界胁迫调控细胞功能的重要蛋白,通过酵母双杂交和pull down实验表明SsAtg1与SsPtc3存在相互作用。SsPTC3缺失后,自噬水平降低,ΔSsptc3的菌丝生长缓慢,胁迫响应和菌核发育异常,致病力显著降低。进一步分析发现ΔSsptc3的侵染垫发育正常,但菌丝在植物细胞内的扩展变慢。综上,PP2C磷酸酶SsPtc3与SsAtg1互作,并参与核盘菌胁迫响应和影响菌核形成及致病力。3.SsAtg1互作蛋白SsAtg13不影响核盘菌致病。Atg13是Atg1复合体的重要组成部分,调控Atg1激酶活性,在酵母中与饥饿条件下维持细胞活性有重要作用。酵母双杂交实验表明SsAtg1与SsAtg13存在相互作用,为解析Atg1复合体调控核盘菌生长发育和致病的作用,对SsATG13进行基因敲除。SsATG13缺失后自噬水平较野生型降低,ΔSsatg13在营养缺陷培养基中菌丝生长速率较野生型缓慢。但与ΔSsatg1不同,ΔSsatg13可以形成菌核且侵染垫形成和致病力与野生型无显著差异。研究表明,SsAtg13与SsAtg1互作,但在核盘菌菌核发育和致病过程中不发selleck合成挥主要作用,进一步证明Atg13功能的多样性且SsAtg1是介导核盘菌菌核形成和致病力的重要蛋白。4.SsTOR调控核盘菌细胞自噬与细胞壁完整性。雷帕霉素靶标TOR(Target of rapamycin)是一类高度保守的Ser/Thr蛋白激酶,是细胞自噬的调控因子。在核盘菌基因组中仅存在一个与酿酒酵母TOR激酶Tor1(47.25%)和Tor2(48.7%)相似的同源蛋白,将其命名为SsTOR。为了探究核盘菌SsAtg1响应营养胁迫的机制与TOR途径的关联,利用RNAi对SsTOR进行基因沉默。SsTOR沉默后,自噬水平显著增加。SsTOR沉默菌株表现为菌丝生长速率显著降低,菌核和侵染垫发育异常且致病力明显下降。磷酸化分析表明,SsTOR参与核盘菌细胞壁完整性通路影响SsSmk3的磷酸化水平。综上,SsTOR是一种调控核盘菌细胞生长、胁迫响应、细胞壁完整性、自噬和致病力的全局调控因子。综上所述,本研究明确了自噬相关基因SsATG1影响核盘菌细胞自噬,并对核盘菌胁迫响应、菌丝生长、菌核发育及致病力起到重要调控作用。解析了SsAtg1与SsPtc3互作参与核盘菌胁迫响应,影响核盘菌致病的相关机制。明确了SsTOR在核盘菌生长发育中的全局调控作用,并探optical biopsy究了SsTOR影响自噬的分子机制。研究结果为自噬蛋白激酶SsAtg1与其他信号途径的相互交联提供了新思路,加深了细胞自噬对于核盘菌菌核发育及致病机制的理解,为菌核病的有效防控提供重要的分子基础。

抑郁症是一种常见的精神障碍疾病，具更多有高度致残性、致命性。西NN2211研究购买医中通常口服抗抑郁药进行治疗，但其治疗周期长、副作用明显、价格高和依从性差，反应率有限、疗效延迟等限制了其应用。越来越多的研究揭示了中药在抑郁症治疗中具有突出的疗效，可作为抑郁症的前瞻性替代疗法。三七是我国中药材，现代研究发现其lethal genetic defect具有抑制神经元凋亡、抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎、神经元保护等药理作用。近年来，三七针对各种抑郁症模型的治疗效果及药理学研究产生了大量的实验数据，然而，三七及其化学成分对抑郁症的潜在影响及机制尚未完全确定。因此，本文综述了三七中的主要化学成分在不同抑郁症模型中的抗抑郁机制，为明确三七抗抑郁的作用机制、推进抑郁症中医药新疗法和新药研发提供理论依据。

甾体化合物(Steroids)是一类广泛存在于动植物体内的脂肪族化合物,对生命活动起着重要的调节作用。由于其显著的生物活性以及对多种疾病的良好治疗效果,因此,甾体类化合物已被开发成为药物。随着甾体化合物的广泛使用。人类对甾体药物的耐药性以及部分甾体激素的药理毒性也凸显出来。为解决这一问题,人们需要开发具有更优生物活性的甾体分子或者通过化学手段对现有的药物的结构进行修饰以减少耐药性和改善药理活性。据报道,思茅藤属植物体内含有一系列具有免疫抑制和抗肿瘤活性的雄甾烯酮类化合物。尤其是其中的雄甾-4(5),6(7),8(9),13(14)-四烯-3,11,16-三酮Navitoclax,其免疫抑制活性与市售的雷公藤内酯和地塞米松相当,在小鼠的为研制免疫抑制剂和抗肿瘤制剂提供先导化合物,具有作为新的免疫抑制药物的潜力。但从思茅藤体Imidazole ketone erastin内进行提取工作困难,8.3 kg思茅藤仅能提取出约25 mg该化合物。由于从植物中提取获得此类化合物的数量有限,难以满足完成细胞机制研究所需的量。需要对其进行化学合成,以供该化合物的研究。本文以廉价的9α-羟基雄烯二酮(9OH-AD)为原料,成功完成天然化合物雄甾-4(5),6(7),8(9),13(14)-四烯-3,11,16-三酮的合成。通过环丙甲醚化,14,15位氧化脱氢,16位臭氧化,17位碘化钐还原脱氧,Oppenauer氧化,环氧化,四氯苯醌(p-Chloranil)氧化等步骤对甾体骨架A,B,C,D环进行修medicinal food饰经过20步反应,最终合成该化合物。在最初完成该产物的合成路线中,环氧化反应的收率仅23%,之后通过对反应步骤顺序优化,成功提高了环氧化步骤的收率至83%。同时利用反应中间体结构的相似性,完成了另外3个类似天然产物的合成,为探索甾体分子生物活性与构效关系奠定了基础。本文的合成方法操作简单,反应条件温和,收率高且环境友好,并通过核磁比对,HRMS,旋光熔点等测定对最终产物结构进行了鉴定。

抗生素等药剂在饲料中的过量添加是影响动物源食品食用安全性的重要因素之一。油脂饼粕中的蛋白质通过微生物发酵可以转化成具有提高动物免疫力的活性多肽,能够部分承担抗生素的作用,因此油脂饼粕发酵受到饲料产业的高度重视。菌种产蛋白酶能力的高低是油脂饼粕蛋白质被转化成为多肽多少的决定性因素,诱变是提高菌种产蛋白酶能力的重要手段。物理诱变具备安全性高、突变稳定性高等优点,且具有多靶点特征的复合物理诱变可以弥补单一诱变的突变局Direct genetic effects限性或抗性饱和现象,突变效果更好。因此,本研究开展了固态发酵方式和产蛋白酶出发菌株的筛选、提高产蛋白酶能力出发菌株的He-Ne激光和紫外联合诱变、基于Ames试验和转录组学的He-Ne激光和紫外两种光源突变机制的探讨、枯草芽孢杆菌中接收红光信号受体蛋白的挖掘等研究工作。主要研究内容与结果如下:(1)豆粕固态发酵方式和产蛋白酶出发菌株的筛选。对比高温固态发酵(枯草芽孢杆菌CICC 22983)和模拟自然变温固态发酵(枯草芽孢杆菌CICC 21927)豆粕两种发酵方式,发现在发酵3天时,霉菌总数显著下降,且大肠菌群<0.3MPN/g,符合卫生指标。模拟自然变温固态发酵组的多肽含量最大为135.63±2.36mg/g。SDS-PAGE、粒径分布和Zeta电位分析发现,模拟自然变温固态发酵在保证发酵质量的前提下,豆粕发酵更彻底。以产蛋白酶和发酵产多肽水平为指标,选取枯草芽孢杆菌CICC 21927作为诱变的出发菌株。(2)He-Ne激光和紫外联合诱变筛选高产蛋白酶突变菌。以微孔板和酶标仪为媒介,建立了产蛋白酶枯草芽孢杆菌CICC 21927的高通量培养、检测和筛选方法。以蛋白酶活为评价指标,优化得到最佳孔板培养条件为:48深孔板、1m L装液量、500 r/min振荡转速、5%接种量,在此条件下,出发菌株的蛋白酶活为58.67 U/m L。采用紫外单独诱变(UV)、激光单独诱变(LA)、先紫外再激光顺序诱变(UL)、先激光再紫外顺序诱变(LU)和紫外激光同步诱变(UV+LA)五种诱变方式对枯草芽孢杆菌CICC 21927进行诱变,发现先激光再紫外顺序诱变(LU)具有最高的正突变率4.30%,而先紫外再激光顺序诱变(UL)降低了枯草芽孢杆菌的致死率。通过初筛、复筛和二次JQ1临床试验诱变筛选到了一株能稳定遗传的突变菌株LU-1-11。16S r DNA序列比较发现,出发菌株和突变菌株均为枯草芽孢杆菌,未发生杂菌污染。模拟自然变温固态发酵豆粕试验发现,突变菌发酵豆粕的多肽含量达到153.1 mg/g,相对于出发菌株提高了12.9Entinostat1%。扫描电镜观察发现,突变菌中大量细胞出现形状不规则,表面皱缩等现象。扩增两株菌的两个中性蛋白酶基因npr E和npr B发现,基因序列未发生变化。基因组重测序结果发现突变菌株产生了5个SNP变异位点和8个结构变异位点,涉及到的基因有deg S、yqb D、yqa S、puc L、srf AA和ync B,其中deg S发生突变可能激活了细胞内蛋白酶的基因,也可能与鞭毛和细胞膜的形成抑制有关,srf AA发生突变可能影响生物膜的形成,使得胞内蛋白酶更容易被释放出来。(3)基于Ames试验的He-Ne激光和紫外辐射导致菌株突变类型研究。以Ames菌株TA97a、TA98、TA100和TA102为模式菌株,以相对回复突变为指标,研究激光和紫外对菌株回复突变以及突变类型的影响。结果表明,激光对TA98和TA100产生回复突变的影响显著高于TA97a和TA102。激光照射30 min后,TA98的回复突变率为对照组的2.16倍。激光照射10 min后,TA100的回复突变率是对照组的3.88倍。紫外照射2 min后,TA102的回复突变率已是对照组的6.68倍。基于1500个激光处理组TA98回复突变体的测序数据发现,激光处理产生了独有的大片段DNA插入和缺失,显著增加了菌株的突变种类。基于760个激光处理组TA100回复突变体的测序数据发现,激光辐射促进了碱基置换中C→A/T的产生。基于192个紫外处理组TA102回复突变体的测序数据发现,紫外辐照更利于菌株发生多向性突变。(4)基于转录组学的He-Ne激光和紫外联合诱变枯草芽孢杆菌机理研究。对五组样本(CK、UV、LA、UL和LU)进行转录组学测序分析,比较CK-vsUV、CK-vs-LA、CK-vs-LU和和CK-vs-UL四个组间差异基因表达量的统计结果发现,与对照组相比,LU组筛选到的差异基因最多。对CK-vs-UV样本关系中的22个差异表达基因进行直接分析发现,紫外通过增强嘧啶类核苷酸合成关键酶类的代谢提高了嘧啶类核苷酸的生物合成。对CK-vs-LA样本关系中的536个差异表达基因进行GO富集和KEGG富集分析发现,激光通过调节跨膜转运蛋白的活性来刺激生长代谢。对UV-vs-LU样本关系中的1891个差异表达基因进行KEGG通路富集分析,针对红光受体光敏色素的结构特征,对双组分系统中显著富集到的89个差异表达基因进行分析后,找到与光敏色素可能相关的组氨酸激酶和其反应调控蛋白的基因。对UV-vs-UL样本关系中的784个差异表达基因进行KEGG通路富集分析发现,与遗传信息过程中的翻译和复制与修复两条代谢途径中的相关基因的表达量发生显示上调,证实激光诱导了紫外损伤的修复功能。选择9个关键基因(lia S、yvf T、yxd K、che A、yko W、uvr C、pcr A、rec A和ruv B)荧光定量PCR检测,发现变化趋势基本上与转录组学数据保持一致。(5)枯草芽孢杆菌中红光受体光敏色素基因分析与功能预测。通过Tbtools软件对枯草芽孢杆菌参考基因组中可能存在的红光受体光敏色素蛋白序列进行比对分析,结合功能结构域预测,推测由基因ytr P编码的二鸟苷酸环化酶可能是枯草芽孢杆菌的类光敏色素。结合转录组学分析发现该基因在UV-vs-LU样本关系中的表达量分别为50.62和102.08,发生显著上调。枯草芽孢杆菌在接受到红光照射后,其ytr P基因编码的蛋白通过GAF结构域接收红光波长信号,进而激活含有GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶和含有EAL结构域的磷酸二酯酶的活性来调控c-di-GMP的浓度,作用于效应蛋白而产生各种生理反应。

抗生素等药剂在饲料中的过量添加是影响动物源食品食用安全性的重要因素之一。油脂饼粕中的蛋白质通过微生物发酵可以转化成具有提高动物免疫力的活性多肽,能够部分承担抗生素的作用,因此油脂饼粕发酵受到饲料产业的高度重视。菌种产蛋白酶能力的高低是油脂饼粕蛋白质被转化成为多肽多少的决定性因素,诱变是提高菌种产蛋白酶能力的重要手段。物理诱变具备安全性高、突变稳定性高等优点,且具有多靶点特征的复合物理诱变可以弥补单一诱变的突变局Direct genetic effects限性或抗性饱和现象,突变效果更好。因此,本研究开展了固态发酵方式和产蛋白酶出发菌株的筛选、提高产蛋白酶能力出发菌株的He-Ne激光和紫外联合诱变、基于Ames试验和转录组学的He-Ne激光和紫外两种光源突变机制的探讨、枯草芽孢杆菌中接收红光信号受体蛋白的挖掘等研究工作。主要研究内容与结果如下:(1)豆粕固态发酵方式和产蛋白酶出发菌株的筛选。对比高温固态发酵(枯草芽孢杆菌CICC 22983)和模拟自然变温固态发酵(枯草芽孢杆菌CICC 21927)豆粕两种发酵方式,发现在发酵3天时,霉菌总数显著下降,且大肠菌群<0.3MPN/g,符合卫生指标。模拟自然变温固态发酵组的多肽含量最大为135.63±2.36mg/g。SDS-PAGE、粒径分布和Zeta电位分析发现,模拟自然变温固态发酵在保证发酵质量的前提下,豆粕发酵更彻底。以产蛋白酶和发酵产多肽水平为指标,选取枯草芽孢杆菌CICC 21927作为诱变的出发菌株。(2)He-Ne激光和紫外联合诱变筛选高产蛋白酶突变菌。以微孔板和酶标仪为媒介,建立了产蛋白酶枯草芽孢杆菌CICC 21927的高通量培养、检测和筛选方法。以蛋白酶活为评价指标,优化得到最佳孔板培养条件为:48深孔板、1m L装液量、500 r/min振荡转速、5%接种量,在此条件下,出发菌株的蛋白酶活为58.67 U/m L。采用紫外单独诱变(UV)、激光单独诱变(LA)、先紫外再激光顺序诱变(UL)、先激光再紫外顺序诱变(LU)和紫外激光同步诱变(UV+LA)五种诱变方式对枯草芽孢杆菌CICC 21927进行诱变,发现先激光再紫外顺序诱变(LU)具有最高的正突变率4.30%,而先紫外再激光顺序诱变(UL)降低了枯草芽孢杆菌的致死率。通过初筛、复筛和二次JQ1临床试验诱变筛选到了一株能稳定遗传的突变菌株LU-1-11。16S r DNA序列比较发现,出发菌株和突变菌株均为枯草芽孢杆菌,未发生杂菌污染。模拟自然变温固态发酵豆粕试验发现,突变菌发酵豆粕的多肽含量达到153.1 mg/g,相对于出发菌株提高了12.9Entinostat1%。扫描电镜观察发现,突变菌中大量细胞出现形状不规则,表面皱缩等现象。扩增两株菌的两个中性蛋白酶基因npr E和npr B发现,基因序列未发生变化。基因组重测序结果发现突变菌株产生了5个SNP变异位点和8个结构变异位点,涉及到的基因有deg S、yqb D、yqa S、puc L、srf AA和ync B,其中deg S发生突变可能激活了细胞内蛋白酶的基因,也可能与鞭毛和细胞膜的形成抑制有关,srf AA发生突变可能影响生物膜的形成,使得胞内蛋白酶更容易被释放出来。(3)基于Ames试验的He-Ne激光和紫外辐射导致菌株突变类型研究。以Ames菌株TA97a、TA98、TA100和TA102为模式菌株,以相对回复突变为指标,研究激光和紫外对菌株回复突变以及突变类型的影响。结果表明,激光对TA98和TA100产生回复突变的影响显著高于TA97a和TA102。激光照射30 min后,TA98的回复突变率为对照组的2.16倍。激光照射10 min后,TA100的回复突变率是对照组的3.88倍。紫外照射2 min后,TA102的回复突变率已是对照组的6.68倍。基于1500个激光处理组TA98回复突变体的测序数据发现,激光处理产生了独有的大片段DNA插入和缺失,显著增加了菌株的突变种类。基于760个激光处理组TA100回复突变体的测序数据发现,激光辐射促进了碱基置换中C→A/T的产生。基于192个紫外处理组TA102回复突变体的测序数据发现,紫外辐照更利于菌株发生多向性突变。(4)基于转录组学的He-Ne激光和紫外联合诱变枯草芽孢杆菌机理研究。对五组样本(CK、UV、LA、UL和LU)进行转录组学测序分析,比较CK-vsUV、CK-vs-LA、CK-vs-LU和和CK-vs-UL四个组间差异基因表达量的统计结果发现,与对照组相比,LU组筛选到的差异基因最多。对CK-vs-UV样本关系中的22个差异表达基因进行直接分析发现,紫外通过增强嘧啶类核苷酸合成关键酶类的代谢提高了嘧啶类核苷酸的生物合成。对CK-vs-LA样本关系中的536个差异表达基因进行GO富集和KEGG富集分析发现,激光通过调节跨膜转运蛋白的活性来刺激生长代谢。对UV-vs-LU样本关系中的1891个差异表达基因进行KEGG通路富集分析,针对红光受体光敏色素的结构特征,对双组分系统中显著富集到的89个差异表达基因进行分析后,找到与光敏色素可能相关的组氨酸激酶和其反应调控蛋白的基因。对UV-vs-UL样本关系中的784个差异表达基因进行KEGG通路富集分析发现,与遗传信息过程中的翻译和复制与修复两条代谢途径中的相关基因的表达量发生显示上调,证实激光诱导了紫外损伤的修复功能。选择9个关键基因(lia S、yvf T、yxd K、che A、yko W、uvr C、pcr A、rec A和ruv B)荧光定量PCR检测,发现变化趋势基本上与转录组学数据保持一致。(5)枯草芽孢杆菌中红光受体光敏色素基因分析与功能预测。通过Tbtools软件对枯草芽孢杆菌参考基因组中可能存在的红光受体光敏色素蛋白序列进行比对分析,结合功能结构域预测,推测由基因ytr P编码的二鸟苷酸环化酶可能是枯草芽孢杆菌的类光敏色素。结合转录组学分析发现该基因在UV-vs-LU样本关系中的表达量分别为50.62和102.08,发生显著上调。枯草芽孢杆菌在接受到红光照射后,其ytr P基因编码的蛋白通过GAF结构域接收红光波长信号,进而激活含有GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶和含有EAL结构域的磷酸二酯酶的活性来调控c-di-GMP的浓度,作用于效应蛋白而产生各种生理反应。

抗生素等药剂在饲料中的过量添加是影响动物源食品食用安全性的重要因素之一。油脂饼粕中的蛋白质通过微生物发酵可以转化成具有提高动物免疫力的活性多肽,能够部分承担抗生素的作用,因此油脂饼粕发酵受到饲料产业的高度重视。菌种产蛋白酶能力的高低是油脂饼粕蛋白质被转化成为多肽多少的决定性因素,诱变是提高菌种产蛋白酶能力的重要手段。物理诱变具备安全性高、突变稳定性高等优点,且具有多靶点特征的复合物理诱变可以弥补单一诱变的突变局Direct genetic effects限性或抗性饱和现象,突变效果更好。因此,本研究开展了固态发酵方式和产蛋白酶出发菌株的筛选、提高产蛋白酶能力出发菌株的He-Ne激光和紫外联合诱变、基于Ames试验和转录组学的He-Ne激光和紫外两种光源突变机制的探讨、枯草芽孢杆菌中接收红光信号受体蛋白的挖掘等研究工作。主要研究内容与结果如下:(1)豆粕固态发酵方式和产蛋白酶出发菌株的筛选。对比高温固态发酵(枯草芽孢杆菌CICC 22983)和模拟自然变温固态发酵(枯草芽孢杆菌CICC 21927)豆粕两种发酵方式,发现在发酵3天时,霉菌总数显著下降,且大肠菌群<0.3MPN/g,符合卫生指标。模拟自然变温固态发酵组的多肽含量最大为135.63±2.36mg/g。SDS-PAGE、粒径分布和Zeta电位分析发现,模拟自然变温固态发酵在保证发酵质量的前提下,豆粕发酵更彻底。以产蛋白酶和发酵产多肽水平为指标,选取枯草芽孢杆菌CICC 21927作为诱变的出发菌株。(2)He-Ne激光和紫外联合诱变筛选高产蛋白酶突变菌。以微孔板和酶标仪为媒介,建立了产蛋白酶枯草芽孢杆菌CICC 21927的高通量培养、检测和筛选方法。以蛋白酶活为评价指标,优化得到最佳孔板培养条件为:48深孔板、1m L装液量、500 r/min振荡转速、5%接种量,在此条件下,出发菌株的蛋白酶活为58.67 U/m L。采用紫外单独诱变(UV)、激光单独诱变(LA)、先紫外再激光顺序诱变(UL)、先激光再紫外顺序诱变(LU)和紫外激光同步诱变(UV+LA)五种诱变方式对枯草芽孢杆菌CICC 21927进行诱变,发现先激光再紫外顺序诱变(LU)具有最高的正突变率4.30%,而先紫外再激光顺序诱变(UL)降低了枯草芽孢杆菌的致死率。通过初筛、复筛和二次JQ1临床试验诱变筛选到了一株能稳定遗传的突变菌株LU-1-11。16S r DNA序列比较发现,出发菌株和突变菌株均为枯草芽孢杆菌,未发生杂菌污染。模拟自然变温固态发酵豆粕试验发现,突变菌发酵豆粕的多肽含量达到153.1 mg/g,相对于出发菌株提高了12.9Entinostat1%。扫描电镜观察发现,突变菌中大量细胞出现形状不规则,表面皱缩等现象。扩增两株菌的两个中性蛋白酶基因npr E和npr B发现,基因序列未发生变化。基因组重测序结果发现突变菌株产生了5个SNP变异位点和8个结构变异位点,涉及到的基因有deg S、yqb D、yqa S、puc L、srf AA和ync B,其中deg S发生突变可能激活了细胞内蛋白酶的基因,也可能与鞭毛和细胞膜的形成抑制有关,srf AA发生突变可能影响生物膜的形成,使得胞内蛋白酶更容易被释放出来。(3)基于Ames试验的He-Ne激光和紫外辐射导致菌株突变类型研究。以Ames菌株TA97a、TA98、TA100和TA102为模式菌株,以相对回复突变为指标,研究激光和紫外对菌株回复突变以及突变类型的影响。结果表明,激光对TA98和TA100产生回复突变的影响显著高于TA97a和TA102。激光照射30 min后,TA98的回复突变率为对照组的2.16倍。激光照射10 min后,TA100的回复突变率是对照组的3.88倍。紫外照射2 min后,TA102的回复突变率已是对照组的6.68倍。基于1500个激光处理组TA98回复突变体的测序数据发现,激光处理产生了独有的大片段DNA插入和缺失,显著增加了菌株的突变种类。基于760个激光处理组TA100回复突变体的测序数据发现,激光辐射促进了碱基置换中C→A/T的产生。基于192个紫外处理组TA102回复突变体的测序数据发现,紫外辐照更利于菌株发生多向性突变。(4)基于转录组学的He-Ne激光和紫外联合诱变枯草芽孢杆菌机理研究。对五组样本(CK、UV、LA、UL和LU)进行转录组学测序分析,比较CK-vsUV、CK-vs-LA、CK-vs-LU和和CK-vs-UL四个组间差异基因表达量的统计结果发现,与对照组相比,LU组筛选到的差异基因最多。对CK-vs-UV样本关系中的22个差异表达基因进行直接分析发现,紫外通过增强嘧啶类核苷酸合成关键酶类的代谢提高了嘧啶类核苷酸的生物合成。对CK-vs-LA样本关系中的536个差异表达基因进行GO富集和KEGG富集分析发现,激光通过调节跨膜转运蛋白的活性来刺激生长代谢。对UV-vs-LU样本关系中的1891个差异表达基因进行KEGG通路富集分析,针对红光受体光敏色素的结构特征,对双组分系统中显著富集到的89个差异表达基因进行分析后,找到与光敏色素可能相关的组氨酸激酶和其反应调控蛋白的基因。对UV-vs-UL样本关系中的784个差异表达基因进行KEGG通路富集分析发现,与遗传信息过程中的翻译和复制与修复两条代谢途径中的相关基因的表达量发生显示上调,证实激光诱导了紫外损伤的修复功能。选择9个关键基因(lia S、yvf T、yxd K、che A、yko W、uvr C、pcr A、rec A和ruv B)荧光定量PCR检测,发现变化趋势基本上与转录组学数据保持一致。(5)枯草芽孢杆菌中红光受体光敏色素基因分析与功能预测。通过Tbtools软件对枯草芽孢杆菌参考基因组中可能存在的红光受体光敏色素蛋白序列进行比对分析,结合功能结构域预测,推测由基因ytr P编码的二鸟苷酸环化酶可能是枯草芽孢杆菌的类光敏色素。结合转录组学分析发现该基因在UV-vs-LU样本关系中的表达量分别为50.62和102.08,发生显著上调。枯草芽孢杆菌在接受到红光照射后,其ytr P基因编码的蛋白通过GAF结构域接收红光波长信号,进而激活含有GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶和含有EAL结构域的磷酸二酯酶的活性来调控c-di-GMP的浓度,作用于效应蛋白而产生各种生理反应。

咔唑和吡唑类化合物是天然产物化学及有机药物化学领域广泛存在的重要杂环化合物,长期以来被应用于材料化学、药物化学及农用化学品等多个领域。如何实现此类杂环体系的高效构建及功能性修饰一直是这类化合物的研究热点,而通过多组分反应构建结构新颖的天然生物碱骨架分子,具有操作简单、原子经济性好等特点。基于此,本文探索了两条多组分反应途径用于高效构建多取代咔唑及芳胺基吡唑衍生物,两类结构共51个化合物,进而通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑)比色法,对所有获得的化合物进行了潜在的抗肿瘤活性评价及结构-活性关系分析,为高效构建新颖的咔唑及吡唑类杂环分子体系提供了新的方法。具体研究内容主要分为两个部分:(1)多组分反应构建咔唑衍生物及其抗肿瘤活性研究采用吲哚、Aldol-X双官能团试剂及1,3-二羰基化合物等为底物,经反应条件筛选优化,通过便利的三组分反应实现了多取代咔唑骨架的高效构建,进而通过结构衍生设计制备得到了一系列具有结构多样性的多取代咔唑衍生物,主要包括咔唑酰胺、咔唑酰肼和咔唑酰腙等三类分子共17个化合物。评估了所有合成的咔唑衍生物对7901(胃腺癌细胞local infection)、A875(人黑色素瘤www.selleck.cn/products/d-lin-mc3-dma)和MARC145(非洲绿猴肾细胞)的体外细胞毒性活性。初步结果表明,化合物14a对7901和A875癌症细胞具有较高的抑制活性,最低IC_(50)分别为11.8±1.26和9.77±8.32μM,可作为新型咔唑类抗癌药物开发的先导分子。(2)多组分一锅法合成吡唑衍生物及其抗肿瘤活性研究采用水合肼、取代异硫氰酸酯及1,3-二羰基化合物等为起始物,经反应条件筛选,最终以最简底物实现了绿色溶剂体系下三组分高效构建芳胺基吡唑杂环骨架分子,并探索了反应机理;该方法底物适应性广,为结构新颖的吡唑衍生物制备提供了一种新的策略。随后,对所获得的共34个多取代吡唑衍生物作为潜在抗癌药物的应用进行了研究,其中18ea、18ec、18h、18s和18z已被证明对A875(人黑色素瘤)和Hep G2(肝癌细胞)细胞系具有优异的抗癌活性,并根据筛选结果讨论了可Crizotinib能的构效关系。激酶测定和分子对接实验表明,这类化合物可能是一种潜在的CDK1抑制剂。

目的：研究转录因子PU. 1在人脑胶selleckchem MG132质瘤中的表达特征，分析PU. 1与病人预后、肿瘤血管生成间的关系，为探索靶向调控肿瘤相关巨噬细胞以治疗脑胶质瘤提供实验基础。方法：收集4例非肿瘤人脑组织样本和23例人脑胶质瘤组织样本，其中WHO-Ⅱ级6例、WHO-Ⅲ级8例、WHO-Ⅳ级9例。Michurinist biology对组织进行染色，观察PU. 1与肿瘤相关巨噬细胞特征性分子Iba1的共定位情况，分析40倍视野下PU. 1阳性细胞数量与胶质瘤病理分级、血管内皮细胞数量的关系。分析TCGA人脑胶质瘤组织中编码PU. 1的基因SPI1的转录水平与胶质瘤病理分级、编码Iba1的基因AIF1的转录水平及病人生存时间的关系。结果：在人脑胶质瘤组织中，PU. 1表达于肿瘤相关巨噬细胞中。非肿瘤组织每个视野中PU. 1阳性细胞平均数量为（1.79±0.30）个，WHO-Ⅱ级脑胶质瘤为（18.56±2.01）个，WHO-Ⅲ级脑胶质瘤为（25.35±3.98）个，WHO-Ⅳ级脑胶质瘤为selleck化学（31.40±2.74）个。PU. 1阳性细胞多组CD31阳性细胞数量平均为（50.36±5.92）个，PU. 1阳性细胞少组CD31阳性细胞数量平均为（33.29±3.73）个。对TCGA人脑胶质瘤数据库分析发现SPI1的转录水平与AIF1的转录水平线性相关，SPI1在WHO-Ⅳ级脑胶质瘤中的转录水平高于WHO-Ⅱ级和WHO-Ⅲ级脑胶质瘤，SPI1的转录水平与脑胶质瘤病人的预后有关，SPI1转录水平高的脑胶质瘤病人预后差。结论：PU. 1是脑肿瘤相关巨噬细胞的特征性转录因子，PU. 1的表达与胶质瘤病理分级相关，PU. 1是潜在的预测脑胶质瘤病人预后的指标，PU. 1可能具有调控肿瘤相关巨噬细胞促进脑胶质瘤血管生成的作用，进一步探索PU. 1在脑胶质瘤血管生成中的作用将为发展脑肿瘤的创新治疗方案提供新思路。

目的 NSC125066配制探讨一氧化氮合酶3(NOS3)基因rs2070744位点的单核苷酸多态性(SNP)与不明原因复发性流产(URSA)的相关性。方法 选取2019年1月至2020年8月甘肃省妇幼保健院复发性流产门诊诊治的150例不明原因复发性流产患者作为研究对象，设为病例组。选取同期进行体检的150例健康女性设为对照组。采用SGenetic ImprintingNaPshot多重SNP分型技术检测两组NOS3基因rs2070744位点的SNP分布情GNE-140体外况。研究组间基因型分布差异，分析NOS3基因rs2070744基因多态性和RSA的相关性。结果 两组文化程度、职业及工作性质比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。在共显性遗传模型中，与T/T基因型相比，携带C/T基因型女性发生URSA的风险降低0.53倍(OR=0.53,95%CI:0.292～0.946)。等位基因模式中，与T等位基因相比，携带C等位基因的孕妇罹患复发性流产的风险降低0.46倍(OR=0.46,95%CI:0.269～0.790)。在显性遗传模型中，与T/T基因型相比，携带C/T-C/C基因型女性发生URSA的风险降低0.47倍(OR=0.47,95%CI:0.265～0.844)。rs2070744位点SNP与环境间交互作用均无统计学意义(P>0.05)。结论 NOS3基因rs2070744基因多态性可能与URSA的患病风险相关，但仍需要在大样本量的病例对照研究和不同人群中进一步验证。