目的:近年来随着纳米科技的迅速发展,纳米材料以其独特的物理化学性质如热稳定性、耐腐蚀性、较高的化学稳定性、良好的生物相容性逐渐较多的应用于航空工业、食品包装以及生物医学等领域。纳米二氧化钛(Titanium Dioxide Nanoparticles,Ti O_2NPs)作为最常用的合成材料之一,预计到2025年其年产量可以达到250万吨,而Ti O_2NP的广泛应用也引起了人们对其安全性的担忧。心血管疾病仍然是造成非传染病负担的主要原因。根据世界卫生组织(Word Health Organization,WHO)统计的数据显示,全球每年有1790万人因心血管疾病而死亡,约占全世界总死亡人数的31%;其中,心脏病发作和中风等疾病占比可高达85%;据预测,到2030年,每年会约有2INCB28060 IC50330万人因心血管疾病而丧失生命。血栓形成是许多心血管疾病发病的主要病理学基础,其中动脉血栓(Arterial Thrombosis,AT)主要是指发生在心脑血管系统中因各种原因所导致的血液异常凝固而形成的血凝块,其病因包括有动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)和易感基因多态性(Susceptibility Gene Polymorphism,SGP)等。血小板在体内可作为平衡机体出血和止血的调节剂,血小板的正常功能在其中发挥着重要的作用。核转录因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,NFE2L2,也简称NRF2)作为机体内适应性抗氧化反应的重要调控因子,可通过启动下游的抗氧化、抗炎、解毒等基因,维持机体氧化还原稳态平衡。有研究提出Nrf2或下游基因的靶向激活可能被证明是开发治疗方法以减少心血管疾病影响的有用途径。本研究旨在揭示Nfe2l2/Nrf2在纳米二氧化钛暴露致小鼠动脉血栓形成中的作用及相关机制,厘清纳米二氧化钛暴露对血小板的影响,以期利用调控NRF2活性等途径为动脉血栓等心血管疾病的防治策略以及纳米二氧化钛的监测预警提供新思路。研究方法:1.小鼠体内模型建立:将小鼠随机分为4组:Nrf2~(+/+)对照组(Nrf2~(+/+),Control)、Nrf2~(-/-)对照组(Nrf2~(-/-),Control),Nrf2~(+/+)暴露组(Nrf2~(+/+),Ti O_2NPs)和Nrf2~(-/-)暴露组(Nrf2~(-/-),Ti O_2NPs)。每组小鼠数量为3-6只不等。用异氟烷口鼻吸入麻醉小鼠,给予静脉注射以体重(g)×10/selleck抑制剂μL的剂量暴露,其中生理盐水作为溶剂对照,Ti O_2NPs注射剂作为暴露组(对应剂量为25 mg/kg体重)。注射1h后,进行动脉血栓模型的建立,并收取小鼠颈动脉病理组织。使用Infectious keratitis37℃生理盐水法检测小鼠鼠尾出血量以及收集小鼠新鲜的血液于含有EDTA商品化的抗凝离心管,可暂时在4℃保存,储存时间不超过24 h,进行相关血液指标检测。2.小鼠体内实验样品处理:使用血细胞分析仪检测血小板的数量及形态学指标,血细胞电阻抗法计数检测血小板聚集率,流式细胞仪检测全血及血小板中的ROS(Reactive Oxygen Species,ROS)水平、血小板P-选择素的表达、血小板的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)外翻及微囊泡(Microvesicles,MVs)的产生情况。通过冰冻切片及免疫荧光染色对小鼠的颈动脉组织进行病理指标进行测定。3.K562细胞体外实验处理:使用人源白血病细胞系K562,基础培养基为IMDM,添加10%胎牛血清及1%的抗青霉素与抗链霉素抗菌药,倍增时间约为72 h。当细胞密度增至60%时,给予纳米二氧化钛暴露(浓度为0,10,25,50,100μg/m L,暴露6 h)后,收取细胞蛋白,观察NRF2蛋白的表达情况。结果:1.本研究所使用的Ti O_2NPs的粒径大小为20～70 nm,平均粒径大小为35.7nm;在生理盐水中,按强度计算的动态尺寸分布是在100 nm的锐钛矿纳米二氧化钛。2.Nrf2缺失小鼠在基础状态下搏动指数(Perfusion Index,PI)升高,而在给予Ti O_2NPs暴露之后PI明显降低,且结果具有统计学意义(P<0.05)。血栓病理组织切片显示Nrf2缺失小鼠在给予Ti O_2NPs暴露之后血栓组织中血小板的沉积增多,提示Nrf2缺失小鼠对Ti O_2NPs暴露致动脉血栓形成更加敏感。3.当给予Ti O_2NPs暴露之后,血小板的聚集率增加;同时纳米二氧化钛可引起血小板的活化增加,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.当给予Ti O_2NPs暴露之后,小鼠血小板内ROS水平、PS外翻及MV的表达情况未见明显改变,提示血小板可能不是通过ROS的产生增加及PS暴露而影响其活化及促凝血活性。5.当给予K562细胞Ti O_2NPs暴露后,NRF2蛋白表达有增加趋势,结果具有统计学差异(P<0.05)。结论:纳米二氧化钛暴露可通过引起小鼠血小板的活化及聚集增加,进而诱发动脉血栓形成。Nrf2缺失小鼠对纳米二氧化钛暴露致动脉血栓易感性更强。