大豆是我国重要粮饲作物之一,然而目前我国大豆大部分还依赖于进口。我国人口众多,人均可用耕地面积有限,充分利用我国后备战略耕地增加大豆可用种植面积可以有效缓解我国大豆供需紧张这一问题。我国后备战略耕地中盐碱地占有很大一部分,虽然大豆是中等耐盐作物,但是盐胁迫仍然是影响大豆产量和质量的重要因素。miR164是一类特殊的小分子RNA,其调控的下游基因为NAC(NAM、ATAF1/2、CUC1/2)家族成员。NAC是一类在植物逆境应答中发挥关键功能的转录因子基因。虽然目前对于miR164在植物盐胁迫的作用有了一定的了解,但是对于miR164在调控大豆盐胁迫应答机制的研究还很缺乏。为了能够解析miR164调控大豆盐胁迫的网络机制,本研究在实验室已有工作的基础上,以miR164d调控大豆盐胁迫应答机制为重点,其主要获得了如下结果:(1)利用大豆瞬时转基因毛状根平板表型技术对miR164d敲低和过表达载体毛状根进行盐胁迫处理,结果显示过表达毛状根的伸长量是对照组的1.3倍,而敲低毛状根的伸长量是对照组的0.75倍。表明miR164d可以调控大豆的盐胁迫应答ruminal microbiota过程。(2)对筛选获得的miR164d纯合突变体植株进行了土壤盐胁迫实验,发现在盐胁迫处理后miR164d突变体植株叶片出现了明显的发黄萎焉。生理生化指标分析发现盐胁迫处理后突变体植株中的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量高于野生型植株,而过氧化氢酶(catalase,CAT)和脯氨酸(Proline,Pro)含量低于野生型。表明敲低miR164d降低了大豆的耐盐性,进一步证实miR164d在大豆应对盐胁迫响应中VX-765核磁起正调控作用,可以增强大豆的耐盐性。(3)通过相关网站预测大豆miR164d的靶基因,并通过基因的差异表达、RLM-5′RACE等实验,验证得到GmNAC34是miR164的靶基因之一,miR164对靶基因GmNAC34的mRNA进行经典切割,剪切位点位于miRNA/target m RNA结合区域第10位和第11位碱基之间。(4)对GmNAC34的组织表达模式进行分析,发现其主要在根中表达。与野生型植株相比,miR164突变体植株中miR164d的表达https://www.selleck.cn/products/cobimetinib-gdc-0973-rg7420.html量降低而GmNAC34表达量上调。(5)利用大豆瞬时毛状根平板表型技术对GmNAC34敲低和过表达毛状根进行盐胁迫处理,结果发现过表达GmNAC34毛状根的伸长量是野生型的0.7倍,敲低GmNAC34毛状根的伸长量是野生型的1.45倍,表明GmNAC34表达量的下降可以提高大豆的耐盐性(6)对GmNAC34盐胁迫下的表达模式进行测定,发现GmNAC34的表达受到盐胁迫的影响,结合其瞬时转基因毛状根平板表型结果,可以发现GmNAC34参与了大豆盐胁迫应答。(7)亚细胞定位发现GmNAC34主要分布在细胞核中。综上所述,实验发现miR164d可以负调控GmNAC34来改变大豆的耐盐性,这为进一步研究miR164在大豆盐胁迫应答中的调控网络的研究提供了基础,也为大豆抗盐育种改善大豆耐盐性提供了可能的候选基因。