背景和目的:放射性肺纤维化(radiation-induced pulmonary fibrosis,RIPF)是接受胸部肿瘤放疗患者与核辐射事故大剂量照射人员常见并发症之一,主要症状表现为体力活动受限、呼吸急促、血氧饱和度降低和呼吸衰竭,临床上除了活体肺移植尚缺乏有效的治疗措施。RIPF的致病机制复杂,II型肺泡上皮细胞(type II alveolar epithelial cells,AT2)的组织损伤修复功能失调是主要的致病因素。放射导致AT2细胞损伤并分泌大量的细胞因子、炎症因子及促纤维化因子,成纤维细胞大量生成并向肌成纤维细胞转化,胶原纤维和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积,组织纤维化形成。最新研究证实,RIPF病灶成纤维细胞主要由肺上皮细胞发生上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)而来,AT2细胞发生EMT是其主要来源之一,AT2细胞的损伤以及发生EMT在肺纤维化的发病机制中发挥关键作用。微小核糖核酸-21(micro RNA-21,miR-21)是最早发现的micro RNAs之一,位于17号染色体上的液泡膜蛋白1(vacuolar membrane protein 1,VMP1)基因座,有研究表明miR-21参与放射诱导的EMT,临床肺纤维化患者的血清和肺泡灌洗液中也发现miR-21表达增高,提示miR-21可能是影响肺纤维化疾病进程的重要调节因子,但是miR-21的下游分子及其通过何种途径参与调节EMT有待证实。因此,本课题的研究目的是探索miR-21在RIPF形成过程中的生物学功能,并筛选miR-21下游的差异表达分子,探索其对放射诱导AT2细胞EMT的作用机制。方法:1.评价miR-21在放射性肺纤维化中的作用(1)建立RIPF动物模型:对6周龄雄性C57BL/6野生型(wild-type,WT)小鼠胸部进行单次剂量为15 Gy的钴源γ射线照射建立RIPF模型。在建模前(F0,n=50)和建模后2周(F2,n=15)、8周(F8,n=30)、16周(F16,n=30),分别通过肉眼观察、活体肺功能检查、胸部Micro-CT检查及肺组织病理分析评价RIPF动物模型。(2)RT-q PCR检测RIPF动物模型肺组织和经放射处理的大鼠II型肺泡上皮细胞系(rat alveolar type II cells,RLE-6TN)miR-21的表达。(3)构建miR-21基因敲除(miR-21~(-/-))小鼠RIPF模型,使用RT~2Profiler PCR Array(QIAGEN)基因表达谱分析技术和RT-q PCR筛选辐照后2周miR-21~(-/-)小鼠与WT小鼠肺组织差异表达基因,通过双荧光素酶报告基因验证miR-21与差异表达分子之间的直接作用关系。(4)RT-q PCR和WB检测RIPF动物模型肺组织和放射诱导RLE-6TN细胞CREBL2的表达。(5)通过I型胶原(collagen I,Col-1)免疫组化染色和(1)中方法评价敲selleckchem VX-661除miR-21基因对小鼠RIPF模型肺纤维化的影响。2.miR-21/CREBL2对放射诱导AT2细胞EMT的影响(1)构建RLE-6TN细胞辐照模型:RLE-6TN细胞处于对数生长期时进行钴源γ射线辐照,总剂量为8 Gy,剂量率为0.65 Gy/min。通过RT-q PCR、WB和细胞免疫荧光染色检测细胞辐照48 h后上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、间质细胞钙黏蛋白(N-cadherin)和成纤维细胞特异蛋白1(fibroblast-specific protein-1,FSP-1)的表达。(2)RT-q PCR检测RLE-6TN细胞转染miR-21 mimic或inhibitor后放射对E-cadherin、N-cadherin和FSP-1的表达调节。(3)RT-q PCR和WB检测过表达或抑制CREBL2后放射诱导RLE-6TN细胞E-cadherin、N-cadherin的表达。3.miR-21/CREBL2介导内质网应激调控放射诱导EMT的作用机制研究(1)免疫组化染色检测RIPF动物模型肺组织内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)和DNA损伤诱导转录因子3(DNA-damage inducible transcript 3,CHOP)的表达。(2)使用钙离子荧光探针Fluo-4AM、RT-q PCR和WB检测放射诱导RLE-6TN细胞钙离子浓度和CHOP表达。(3)RT-q PCR和WB检测过表达或抑制CREBL2后放射诱导RLE-6TN细胞CHOP表达。(4)RT-q PCR和免疫组化染色检测RIPF动物模型肺组织CHOP的表达。(5)RT-q PCR检测过表达或抑制CHOP后放射诱导RLE-6TN细胞E-cadherin、N-cadherin、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。(6)分别通过活体肺功能检查、羟脯氨酸检测、肺组织病理分析评价4-苯基丁酸CX-5461溶解度钠(4-Phenylbutyric acid sodium,4-PBA)腹腔连续注射4周对RIPF动物模型肺纤维化的影响。结果:1.miR-21促进放射性肺纤维化的形成(1)建模16周后,WT小鼠胸部毛发完全变白变少,肺组织呈红褐色且表面散在白色结节;肺功能如呼吸系统阻力、组织能量衰减和小气道阻力等反应组织损伤的指标显著增加;Micro-CT检查发现肺部出现不均匀的斑片状阴影和蜂窝状改变;病理染色显示肺组织大量肺泡闭锁、胶原纤维沉积于肺泡间隔,表明RIPF动物模型构建成功。(2)miR-21在RIPF动物模型中表达上调,RLE-6TN细胞辐照后miR-21表达同样上调。(3)基因芯片和RT-q PCR筛选发现CREBL2与miR-21呈负相关,双荧光素酶实验证实miR-21直接作用于CREBL2-3’UTR区域。(4)CREBL2在RLE-6TN细胞和WT小鼠辐照模型中表达下调,而在敲除miR-21基因的小鼠肺组织中表达上调。(5)miR-21~(-/-)小鼠建模16周后胸部毛发稍变少,肺组织呈粉红色外观;Micro-CT检查发现肺组织密度影增高,CT三维重建未发现组织缺损;肺功能损伤程度明显小于WT小鼠,肺系数增加不明显,羟脯氨酸和Col-1少量沉积于肺组织,以上结果表明敲除miR-21基因明显减轻小鼠RIPF的形成。2.miR-21/CREBL2促进放射诱导的AT2细胞EMT(1)显微镜下观察发现RLE-6TN细胞辐照后数量减少,形态由鹅卵石不规则样上皮细胞向长biocultural diversity条形或梭形细胞转变;WB和细胞免疫荧光染色检测表明RLE-6TN细胞辐照48 h后E-cadherin表达下调,N-cadherin和FSP-1表达上调。(2)转染miR-21inhibitor,RLE-6TN细胞辐照后通过RT-q PCR检测发现E-cadherin表达上调,N-cadherin和FSP-1表达下调;与之相反,转染miR-21 mimic使RLE-6TN细胞辐照后E-cadherin表达下调,N-cadherin和FSP-1表达上调。(3)转染CREBL2过表达质粒,RLE-6TN细胞辐照后E-cadherin表达上调,N-cadherin和FSP-1表达下调;抑制CREBL2的表达使RLE-6TN细胞辐照后E-cadherin表达下调,N-cadherin和FSP-1表达上调。综上所述,miR-21/CREBL2促进放射诱导AT2细胞发生EMT。3.miR-21/CREBL2通过激活内质网应激促进放射诱导AT2细胞向间质细胞转化(1)免疫组化染色表明RIPF动物模型肺组织中GRP78和CHOP随建模时间的增长而表达增强。(2)RLE-6TN细胞辐照后细胞内钙离子浓度显著增加,CHOP表达上调。(3)转染CREBL2过表达质粒,RLE-6TN细胞辐照后CHOP表达下调;反之,抑制CREBL2的表达使RLE-6TN细胞辐照后CHOP表达上调。(4)通过RT-q PCR和免疫组化染色发现RIPF动物模型中WT小鼠肺组织CHOP的表达显著高于miR-21~(-/-)小鼠。(5)转染CHOP过表达质粒,RLE-6TN细胞辐照后E-cadherin表达下调,N-cadherin和α-SMA表达上调;抑制CHOP的表达使RLE-6TN细胞辐照后E-cadherin表达上调,N-cadherin和α-SMA表达下调。(6)4-PBA组RIPF动物模型辐照16周的肺功能指标如形态常数、深吸气量和静态顺应性等明显优于Saline组;羟脯氨酸含量和胶原纤维生成较Saline组低。以上实验结果表明miR-21/CREBL2通过ERS促进放射诱导AT2细胞发生EMT,介导RIPF的形成。结论:本研究证实miR-21参与RIPF的病理过程,发现miR-21新的靶基因CREBL2。揭示miR-21/CREBL2通过放射增强ERS信号通路诱导AT2细胞发生EMT的调控机制,为RIPF的防治提供了潜在的靶点。