研究背景肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是一类进展性、发病相对较少的肺血管疾病,最终导致右心衰竭甚至死亡。PAH病因复杂,其中低氧是PAH的重要外源性刺激因素之一。在PAH发展过程中涉及的病理改变主要有炎性细胞浸润、微血栓的形成、肺血管持续收缩和肺微小动脉重构。目前已被证实肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)过度迁移和增殖所导致的肺小动脉重构是PAH的主要病理机制。PAH因临床治疗方式有限,疾病进展迅速,且具有病情重、预后差及死亡率高的特点,被称为“心血管中的癌症”。既往文献报道,PAH患者5年生存率仅为57%,原因主要是与PAH发生过程中肺血管重构的分子机制尚不十分清楚相关。因此,亟需深入探究肺血管重构的分子机制,为探寻PAH治疗的新策略和新靶点提供依据。已有研究表明,多种miRNAs参与了PAH的发生和发展。本课题前期临床筛查实验发现,miR-26a-5p在PAH患者循环血中水平明显降低,同时在PASMCs中的表达也明显下降,且与肺动脉压力水平呈明显负相关。因此课题构建了PAH的动物模型,并利用细胞生物学手段,针对miR-26a-5p在PAH发展过程中的作用展开研究。目的通过临床、细胞学水平和动物模型确认miR-26a-5p与PAH的关系,并研究miR-26a-5p在PASMCs增殖、迁移、自噬中的作用和作用机制,从而为临床提供PAH治疗的新靶点和新思路。方法1.在临床上再次确认miR-26a-5p与PAH的相关性收集2018年1月至2021年7月在长海医院心血管内科或心血管外科住院经右心导管检查的28例先天性心脏病患者的病例资料和血清、肺组织标本(其中合并PAH组14例、不合并PAH组14例),并收集健康对照的11例血清标本。分析患者基线资料,并用RT-q PCR测定miR-26a-5p在血清和肺组织中的表达。2.在细胞学水平研究miR-26a-5p在低氧刺激下的PASMCs增殖、迁移和自噬过程中的作用和机制(1)在细胞水平通过miR-26a-5p模拟物和其抑制剂调节表达水平,分别利用Beyo Click~(TM) EDU染色实验和CCK8实验来检测miR-26a-5p对PASMCs增殖能力的影响;经划痕愈合实验和Transwell迁移实验检测miR-26a-5p对PASMCs水平和垂直迁移能力的影响;Western Blot实验观察miR-26a-5p在不同缺氧时间、不同增殖模型以及不同细胞系中表达水平差异;同时测定miR-26a-5p对PASMCs自噬标志物LC3和p62表达水平的影响,通过激光共聚焦荧光显微镜和电镜下观察自噬流变化。(2)miR-26a-5p作用机制的研究首先,在h PASMCs中转入HIF-1αsi RNA,检测miR-26a-5p的表达水平,并经染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)Albright’s hereditary osteodystrophy实验来探究HIF-1α是否可以与miR-26a-5p的启动子区相结合,采用双荧光素酶报告实验来检测HIF-1α过表达或敲减对miR-26a启动子活性的影响;其次,通过生信网站预测miR-26a-5p下游靶基因,预测PFKFB3和ULK1/2是miR-26a-5p结合靶点,并通过双荧光素酶实验验证;然后,应用miR-26a-5p模拟物,验证其对PFKFB3和ULK1/2蛋白表达的抑制作用;最后,构建PFKFB3 si RNA转染PASMCs,观察其对ULK1/2磷酸化的调控作用和对低氧诱导自噬的调控作用。同时应用PFKFB3过表达质粒转染PASMCs观察其能否逆转miR-26a-5p模拟物作用。3.分析在大鼠PAH模型上高表达miR-26a-5p对PAH病变的影响采用雄性8周龄SD大鼠,分为4组:对照组(常氧组,21%O_2)、常氧+Ad-GFP组、低氧+Ad-GFP组、低氧+Ad-miR-26a-5p组,低氧组采用10%O_2处理。大鼠麻醉后,常氧组分别经气管间歇注入0.9%氯化钠注射液200μl、Ad-GFP溶液200μl(终浓度1×10~9PFU/ml);低氧处理后大鼠分别经气管注入Ad-GFP溶液200μl(终浓度1×10~9PFU/ml)、Ad-miR-26a-5p溶液200μl(终浓度1×10~9PFU/ml)。以上四组大鼠(每组6只)常规饲养四周后,检测大鼠右心室血流动力学指标,HE染色考察肺动脉壁和右室壁厚度,RT-q PCR法分析PFKFB3 m RNA和蛋白水平,Western blot法和免疫荧光法考察自噬水平,PCNA免疫组化染色考察受损PASMCs增殖情况。结果1.临床先天性心脏病合并PAH的患者血清miR-26a-5p水平明显低于不合并PAH患者和健康对照者(P<0.05);合并PAH患者的肺动脉组织中miR-26a-5p表达水平也明显低于不合并PAH患者(P<0.05);血清miR-26a-5p表达水平与平均肺动脉压呈现负相关(rs=-0.322,p<0.05);2.在细胞学水平的研究(1)低氧刺激下,miR-26a-5p模拟物可明显抑制PASMCs的增殖活性和迁移能力;相反,miR-26a-5p抑制物可增强PASMCs的增殖活性和迁移能力。同时,在PASMCs三种增殖模型中,miR-26a-5p表达均出现下调。低氧环境下,miR-26a-5p模拟物可以增加自噬底物p62表达水平,降低LC3II/I比值,而miR-26a-5p抑制物则结果相反。(2)染色质免疫共沉淀结果HIF-1α可以与miR-26a-5p的启动子区域结合从而调节miR-26a-5p的表达。双荧光素酶报告实验表明,过表达HIF-1α降低了miR-26a-5p 3’UTR的荧光活性,而敲减HIF-1α则增强miR-26a-5p 3’UTR的荧光活性,而miR-26a结合位点发生突变则细胞的荧光活性并没有明显变化。(3)经生物信息网站预测PFKFB3和ULK1/2是miR-26a-5p的结合靶点,并且在PFKFB3和ULK1/2的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)中Berzosertib发现结合位点。在HEK293T细胞中过表达miR-26a-5p,同时转染PFKFB3或ULK1/2的WT 3’UTR。双荧光素酶实验提示:与对照组相比,过表达PFKFB3或ULK1/2组荧光素酶活性明显受到抑制;而将PFKFB3或ULK1/2 3’UTR突变,其荧光素酶活性没有改变。在低氧刺激下,PFKFB3蛋白表达水平增加;miR-26a-5p mimic抑制低氧诱导的PFKFB3或ULK1/2蛋白水平的上调。同时,在低氧刺激下,ULK1的磷酸化水平增强;敲低PFKFB3,可以抑制ULK1的磷酸化水平。在PASMCs中,敲低PFKFB3可以抑制低氧诱导的自噬;PFKFB3过表达则逆转miR-26a-5p mimic在低氧情况下对PASMCs增殖和迁移的抑制作用。3.在大鼠PAH模型上的研究大鼠在低氧环境刺激下,右室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP)、右室重量/(左室+室间隔)重量[RV weightStaurosporine纯度/(LV+Septal)weight,简写为RV/(LV+Sep)]、右室厚度和肌化肺小动脉壁比例明显增加。经支气管给予Ad-miR-26a-5p可以显著降低RVSP、RV/(LV+Sep)、右室厚度和肌化肺小动脉壁比例;同时下调肺组织中PFKFB3 m RNA和蛋白水平,并显著抑制受损肺组织中自噬水平,降低肺动脉组织中PCNA阳性细胞数目。结论1.PAH患者miR-26a-5p水平与PAH发病程度呈显著负相关;在细胞学研究中发现miR-26a-5p可以抑制低氧诱导的细胞增殖、迁移以及细胞内自噬流的发生。2.miR-26a-5p表达受到HIF-1α的调控;PFKFB3和ULK1/2是miR-26a-5p的下游靶基因;同时PFKFB3也是ULK1磷酸化的重要调控因子;3.HIF-1α/miR-26a-5p/PFKFB3/ULK1/2信号通路在低氧诱导的PASMCs增殖和迁移作用中起着重要的作用;过表达miR-26a-5p可以显著下调PFKFB3表达,抑制自噬和增殖,改善肺动脉重构,减轻长期低氧诱导的PAH进展。因此,研究提示临床上通过调控miR-26a-5p表达水平,可以减轻PAH的发展进程,这可能成为PAH治疗的新靶点。