动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种在临床上具有较高的发病率和死亡率的慢性炎症性进展性的血管炎症性疾病,病变起因为炎症细胞浸润和脂质沉积。近年来关于METTL3(methyltransferase-like protein 3)以及m6A(N6-methyladenosine)修饰在AS中的作用引起广泛关注,有研究表明METTL3介导的m6A修饰可在诱导内皮细胞的炎症反应、促进M1巨噬细胞的极化、促进氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)介导的炎症反应和血管生成等方面来促进AS的发生。METTL3作为催化甲基化修饰的关键酶,能够在AS中广泛表达,并且METTL3的敲低能够降低血脂水平和抑制斑块形成。迄今为止,METTL3在ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡发生发展的具体机制还未明确。本研究将以ox-LDL诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)巨噬细胞,同时在体内外进行METTL3敲低和过表达干预,探究METTL3通过促进ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡和炎症反应参与AS的发生发展。目的:探究METTL3在体外对ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡的影响及METTL3在体内对动脉粥样硬化的影响。方法:1.ox-LDL(50μg/ml)孵育RAW264.7细胞不同时间后,总胆固醇试剂盒检测细胞内胆固醇含量,荧光定量PCR和Western blot法检测METTL3和细胞焦亡相关基因NLRP3、NF-κB p6Medial approach5、GSDMD-N、Caspase-1、IL-1β、IL-18的m RNA和蛋白表达水平。然后对METTL3进行敲低和过表达,检测培养细胞中总RNA m6A甲基化水平。RT-PCR和Western blot法检测在ox-LDL诱导和METTL3干预后METTL3和细胞焦亡相关基因m RNA和蛋白表达水平;乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测和Calcein AM/PI染色评估细胞焦亡情况;酶联免疫吸附法检测炎症因子IL-1β、IL-10、IL-18、TNF-α和IL-6的含量。2.选取10只apo E~(-/-)正常饲料喂养小鼠设为对照,选取50只apo E~(-/-)小鼠连续喂养12周高脂饲料建立高脂模型,然后从中随机选取40只进行后续实验,每组10只,进行尾静脉注射病毒,建立以下实验分组:METTL3过表达慢病毒阴性对照(OE-Control);METTL3过表达慢病毒(OE-METTL3);METTL3敲低对照病毒(METTL3-sh NC);METTL3敲低慢病毒(LV3-METTL3),注射周期为每周注射2次,连续注射四周,期间继续高脂喂养,剩余10只全程喂养高脂饲料。METTL3干预后Western blot法检测METTL3的敲低和过表达效果,并检测各组小鼠中METTL3的表达;斑块进展情况用主动脉大体油红O染色、主动脉窦冰冻切片油红O染色和HE染色评估;然后用试剂盒检测6组小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C的生化水平;Western blot法检测主动脉中焦亡相关基因的蛋白表达水平;血清中炎症因子的表达用酶联免疫吸附法检测,从而进一步验证METTL3对动脉粥样硬化及细胞焦亡的影响。结果:1.ox-LDL(50μg/ml)孵育RAW264.7细胞后,总胆固醇含量随着诱导时间的延长显著增加(P<0.05);且与对照组相比,细胞焦亡相关基因NLRP3、IL-1β、NF-κB p65、GSDMD-N、IL-18、Caspase-1的m RNA和蛋白表达水平增加(P<0.05);此外,本研究还发现ox-LDL(50μg/ml)诱导RAW264.7细胞后METTL3和RNA m6A的表达显著上调(P<0.05)。2.通过敲低和过表达METTNaporafenib半抑制浓度L3,利用荧光定量PCR、Western blot、LDH细胞毒性检测和Calcein AM/PI染色法、ELISA证实METTL3能够促进巨噬细胞的焦亡和炎症因子的表达。3.高脂饲料喂养后,METTL3的表达显著升高,且METTL3过表达后升高最为明显。主动脉大体油红O染色和主动脉窦冰冻切片油红O染色和HE染色显示METTL3过表达后斑块形成最为明显,泡沫细胞大量聚集,炎性细胞浸润。4.与正常饲料喂养小鼠相比,高脂喂养的小鼠中TC、LDL-C、TG水平上调,而HDL-C水平下调。同高脂喂养的apo E~(-/-)小鼠相比,METTL3过表达组TC、TG、LDL-C水平显著升高(P<0.05),METTL3敲低组HDL-C显著升高(P<0.05)。同METTL3过表达阴性对照组相比,METTL3过表达后,TG、TC、LDL-C水平显著升高(P<0.05)。同METTL3敲低对照组相比,METTL3敲低后,TG、TC、LDL-C水平显著下调(P<0.05),HDL-C水平显著上调(P<0.05)。5.METTL3过表达增加了焦亡相关基因的表达。6.高脂喂养的apo E~(-/-)小鼠中IL-18、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05),IL-1β升高,IL-10水平显著降低(P<0.05)。同高脂喂养的apo E~(-/-)小鼠相比,METTL3过表达组IL-1β、IL-18、TNF-α水平显著升高(P<0.05)。同METTL3过表达阴性对照组相比,METTL3过表达后,selleckIL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平显著升高(P<0.05)。同METTL3敲低对照组相比,METTL3敲低后,IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平显著降低(P<0.05),IL-10水平显著升高(P<0.05)。结论:1.ox-LDL能够诱导巨噬细胞的焦亡,上调METTL3的表达和RNA m6A甲基化水平,而METTL3能够明显促进ox-LDL诱导的巨噬细胞的焦亡和炎症因子的表达。2.METTL3在体内上调动脉粥样硬化小鼠的血脂水平,并通过促进细胞焦亡和炎症反应加剧AS斑块形成。