研究背景:糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者的常见并发症,是终末期肾病(ESRD)主要发病原因,也是欧美国家患者透析的首要病因,并逐渐发展为我国患者需透析治疗的最主要继发性肾脏病。目前预防和治疗DN的方案有限,给患者和社会都带来极大压力,因此有效治疗DN至关重要。关于DN发病机制和治疗的研究很多,迄今尚无有效控制DN发生和进展的药物。炎症反应是DN发生发展的主要原因,肾组织发生炎症反应使肾小管和肾小球细胞的功能和结构发生改变,逐渐肾纤维化最终导致ESRD。DN还引起肠道菌群失调及肠道屏障功能受损,增加肠源性毒素的产生及肠腔细菌、内毒素的易位,毒素加重全身性炎症。DN患者微炎症的原因之一就是肠道菌群失调引起菌群易位和内毒素吸收入血,糖尿病患者常在发生肠道菌群易位后进展为DN。番茄提取物Lycoperoside H(LH)是甾体生物碱糖苷。实验表明LH可以作用于IL-33转基因小鼠,抑制炎性细胞因子水平,具有良好的抗炎、免疫调节作用。结合DN发病机制,LH可能通过抗炎保护肾脏,但其对DN的作用及机制尚待进一步研究。研究方法:1.LH和番茄红素(Lycopene,LY)抗DN作用细胞学筛选:观察在高糖刺激下,LH和LY对肾小球系膜细胞增殖的影响,对过氧化氢损伤的肾小管上皮细胞的保护作用,以及LH和LY对高糖刺激的巨噬细胞增殖和细胞因子分泌的影响。2.LH对高糖刺激的巨噬细胞转录组学的影响:通过转录组测序获得对照组(常糖+巨噬细胞),模型组(高糖+巨噬细胞)及LH给药组(LH+高糖+巨噬细胞)组间差异基因,并对上述基因进行q-PCR,Westernblot验证LH可能的抗炎作用靶点。3.观察LH对STZ诱导的DN大鼠肾脏的保护作用:将SD大鼠分为正常对照组(NC组),STZ诱导的DN组,DN+LH治疗组三组。分别测定大鼠血糖水平、肾脏参数、脂质参数、抗氧化参数、细胞因子和炎症介质、糖基化终末产物等,评价LH抗DN的作用及可能的机制。4.基于微生物组探讨LH改善DN机制:通过提取粪便DNA和16s r RNA测序检测NC组、DN组、DN+LH治疗组大鼠的肠道菌群,获得细菌的相对丰度、厚壁菌门/拟杆菌门比例、辛普森指数、香农指数、Chao1和AceAnthroposophic medicine指数,揭示DN与肠道菌群变化的关系。进一步采用检索人类DN数据集并GO富集分析,获得人类DN与正常对照组的差异基因,进而聚类分析获得LH通过调节肠道菌群改善DN的相关上调及下调基因和信号通路。研究结果:1.LH和LY能抑制巨噬细胞系分泌炎症介质NO和IL-6。LH在0.62GDC-0973试剂5μg/ml时能明显减少高糖刺激的巨噬细胞分泌NO。LH和LY对高糖诱导的系膜细胞增殖无明显抑制作用;0.3125,0.625μg/ml两个浓度的LH对过氧化氢损伤的肾小管上皮细胞有保护作用。2.转录组学检测获得高糖巨噬细胞模型组与LH组差异基因上调基因5个,分别为Rps27rt,Rab15,Ptpn5,Entpd4,Pcdhgb2;下调基因5个,分别为Tmem254c,Gm2007,Asdurf,Cd300e,Pcdhga4。差异基因主要集中在代谢,遗传信息处理以及MAPLY2157299体内K信号通路。LH负调控高糖刺激的巨噬细胞Cd300e基因转录和蛋白表达。3.LH对于DN大鼠的保护作用及炎症影响:与DN组相比,LH治疗降低尿白蛋白、尿微量白蛋白/肌酐比值,以及及血清肌酐、尿素氮水平,使甘油三酯、高脂蛋白、总胆固醇和低密度脂蛋白水平、抗氧化丙二醛、氧化型谷胱甘肽下降,升高还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶,抑制细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β、COX-2和PGE2产生,升高IL-10水平。4.LH对于DN大鼠肠道菌群的影响:LH显著增强瘤胃球菌科丰度,抑制梭状芽孢杆菌和蠕动杆菌的丰度,使F/B比值降低。获得人类DN与正常对照组的差异基因,大鼠动物实验中涉及到的基因和人类DN数据集中涉及到的交集基因为IL10、IL1B和CDKN1A。GO富集分析结果示白细胞活化和增殖的调节可能是LH通过调节肠道菌群改善DN的关键通路。结论:1.LH和LY都能抑制巨噬细胞系(RAW264.7)分泌炎症介质NO和IL-6,对高糖诱导的系膜细胞(SV40MES13)增殖无明显抑制作用。浓度为0.625μg/ml的LH对过氧化氢损伤的肾小管上皮细胞(HK-2)具有保护作用。2.LH治疗可降低STZ诱导的DN大鼠肾病相关指标,降低尿微量白蛋白/肌酐、血肌酐、尿素氮等,可能与抑制炎症相关细胞因子,改善高血糖引起的氧化应激等机制有关。3.LH在细胞水平通过抑制高糖诱导巨噬细胞Cd300e m RNA及蛋白表达,减少促炎因子分泌;在整体动物水平,LH抑制肾组织表达Cd300e蛋白,可能成为LH改善DN的机制之一。4.LH抑制F/B比值,通过调节肠道微生物群调节IL10、IL1B和CDKN1A基因表达。LH可能通过改变肠道菌群的种类和丰度,减少促炎因子分泌而改善DN。