仔猪腹泻是生猪规模化养殖过程中常见的肠道疾病之一,导致仔猪生长缓慢和死亡,严重影响养猪业的健康发展。C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C)产生的beta2毒素(CPB2)损害仔猪肠道,引起仔猪坏死性肠炎。目前,通过使用抗生素和疫苗等在一定程度上控制了仔猪腹泻的发生,但随着食品安全和环境污染等问题的出现及绿色无抗养殖的呼吁,给仔猪腹泻的防治带来了新的挑战。因此,从分子遗传角度研究仔猪抵抗病原菌感染的腹泻机制,在本质上提高仔猪抗腹泻能力,已成为防治仔猪腹泻的重要途径之一。LncRNA和miRNA参与调控病原微生物感染引起的肠道疾病,但其在仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻中的功能及调控机制尚不清楚。鉴于此,本研究基于课题组前期C型产气荚膜梭菌感染仔猪回肠组织RNA-seq数据,筛选出在腹泻仔猪回肠组织和CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中共同差异表达的lnc RNA和miRNA,构建lnc RNA-miRNA-m RNA调控网络。利用RT-q PCR、Western Blot、ELISA、Ed U染色、流式细胞术、双荧光素酶基因报告等试验研究lnc RNA和miRNA在CPB2毒素诱导IPEC-J2细胞损伤中的调控机制。主要研究结果如下:(1)以FDR<0.05、FPKM>1和|log_2 FC|>1为筛选条件,同时剔除没有靶基因的lnc RNA,在课题组前期RNA-seq数据中筛选出靶基因富集在炎症、免疫相关通路的6个差异表达lnc RNAs,利用RT-q PCR检测这6个差异表达lnc RNAs在腹泻(易感和耐受)仔猪回肠组织和CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞中的表达。结果表明,lnc001776在组织和细胞中的差异倍数均最大,且在两者中均极显著上调表达(P<0.01)。组织表达谱结果显示,lnc001776在仔猪十二指肠、空肠和回肠表达较高。5'和3'RACE试验得到lnc001776全长序列为3386bp。过表达lnc001776增加了促炎细胞因子表达水平、LDH活性和ROS水平,降低了抗炎细胞因子表达水平、SOD活力和细胞活力,抑制细胞购买Elexacaftor增殖,促进细胞凋亡,破坏细胞紧密连接,进而加重CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞损伤。敲低lnc001776可改善CPB2毒素对IPEC-J2细胞的损伤作用。细胞质核分离试验和RNA-FISH结果表明,lnc001776主要定位于IPEC-J2细胞质。同时,筛选出与lnc001776存在结合位点且表达负相关的差异miRNA(ssc-let-7i-5p),预测其靶基因,筛选与炎症、免疫感染性疾病相关的靶基因,与差异m RNA取交集,预测出了可能的lnc001776/ssc-let-7i-5p/IL-6 ceRNA调控网络。(2)ssc-let-7i-5p在腹泻仔猪回肠组织和CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中极显著下调表达(P<0.01),并在CPB2毒素处理24 h时表达最低(P<0.01)。组织表达谱结果表明,ssc-let-7i-5p在仔猪回肠中表达最高,在脾脏、空肠、肺脏和肝脏中呈中高表达。过表达ssc-let-7i-5p对ROS水平和SOD活力无显著影响,但可抑制促炎细胞因子表达水平、LDH活性和细胞凋亡,提高抗炎细胞因子表达水平和细胞活力,促进细胞增殖,改善肠上皮屏障功能,从而缓解CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞损伤。(3)双荧光素酶活性试验表明ssc-let-7i-5p分别与lnc001776和IL-6能够特异性结合。过表达lnc001776降低ssc-let-7i-5p的表达,增加IL-6的表达,敲低lnc001776存在相反的结果。此外,ssc-let-7i-5p的过表达Crizotinib molecular weight抑制了lnc001776对IL-6表达的正向调控,确定lnc001776/ssc-let-7i-5p/IL-6调控网络成立。挽救试验表明ssc-let-7i-5p的过表达阻断了lnc001776对CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞炎症、凋亡和紧密连接紊乱的促进作用,而过表达IL-6抑制了ssc-let-7i-5p对lnc001776的阻断作用,从而恢复lnc001776对CPBbioactive endodontic cement2毒素诱导的IPEC-J2细胞的损伤作用。综上所述,lnc001776/ssc-let-7i-5p/IL-6互作网络对CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞损伤具有重要的调控作用,即lnc001776通过海绵吸附ssc-let-7i-5p调节下游靶基因IL-6的表达,进而促进CPB2毒素诱导的IPEC-J2炎症反应、凋亡和肠屏障功能紊乱,最终加剧CPB2毒素对IPEC-J2细胞的损伤。本研究结果可为进一步揭示lnc RNAs在仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻中的作用机制提供理论依据。