研究背景、目的脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种极其严重的中枢神经系统创伤性疾病,会导致患者永久的神经功能障碍和运动功能障碍,且目前尚无有效的治疗手段。血脊髓屏障(Blood-spinal cord barrier,BSCB)是位于血液和脊髓实质之间的屏障,可以防止有害物质进入脊髓。损伤早期保护血脊髓屏障对限制脊髓损伤的继发性破坏和促进脊髓损伤的修复至关重要。铁死亡主要发生在脊髓损伤早期,在脊髓微环境失衡中具有关键作用。本课题组前期研究表明,系统性抑制铁死亡能有效改善脊髓损伤的远期恢复效果。然而铁死亡与脊髓损伤后血脊髓屏障继发性破坏之间的关系尚不清楚。因此,本研究进一步探究铁死亡在血脊髓屏障的继发性破坏中的作用,揭示血管内皮细胞(Endothelial cell,EC)发生铁死亡的关键通路,阐明铁死亡抑制剂早期给药保护血脊髓屏障免于继发性破坏的关键机制,为脊髓损伤的修复提供新靶点和新思路。研究方法1.应用Impactor Model Ⅲ打击器建立大鼠中度脊髓挫伤模型,造模条件为打击高度25 mm、打击重量10 g。实验动物分组:体重在220-240 g之间的8周龄雌性Wistar大鼠,随机分为3组:假手术组(Sham组),单纯损伤组(SCI组),Liproxstatin-1(Lip-1)干预组(Lip-1组)。1 mL Lip-1在造模后30 min通过腹腔注射给药,每日1次,持续3天。2.伊文思蓝(Evansblue,EB)渗漏实验检测血脊髓屏障的通透性;紧密连接蛋白ZO-1(Zonula occludens-1)的免疫荧光实验检测血脊髓屏障的功能。3.建立脑微血管内皮细胞(bEnd.3)铁死亡模型,检测其铁死亡相关指标的含量及其表达的紧密连接蛋白的变化。基于大鼠脊髓损伤模型,将血管内皮细胞(标志物:RECAI)分别和铁死亡关键酶ACSL4、15-LOX做免疫荧光共染,RECA1与ACSL4、15-LOX荧光的共定位分析揭示Lip-1对血管内皮细胞铁死亡的抑制作用。4.使用CD68标记大鼠脊髓组织中巨噬细胞、MPO标记中性粒细胞,检测损伤部位CD68和MPO的荧光强度观察免疫细胞的浸润情况。5.通过对大鼠脊髓组织星形胶质细胞(GFAP)和神经元(NeuN)的免疫荧光染色检测Lip-1的神经保护作用。通过行为学评价(BBB评分、CatWalk步态分析),电生理检测(感觉诱发电位、运动诱发电位)和组织学染色(H&E染色)等观察Lip-1的修复效果。研究结果1.铁死亡抑制剂Lip-1减轻大鼠脊髓损伤后血脊髓屏障的继发性破坏伊文思蓝染色结果显示损伤后3天,大鼠脊髓组织有明显的蓝色染料渗漏,Lip-1治疗后,血脊髓屏障的渗漏明显减轻。血管内皮细胞(RECA1)和紧密连接蛋白(ZO-1)的免疫荧光共定位染色显示脊髓损伤后3天ZO-1在血管内皮细胞Dorsomorphin molecular weight中的表达减少,Lip-1可以增加血管内皮细胞中ZO-1的表达量。2.Lip-1抑制bEnd.3细胞铁死亡并增加其紧密连接蛋白的表达7.66 μM的RSL3(CC50)诱导bEnd.3细胞发生铁死亡后,细胞中GSH含量减少,GPX4表达减少;ACSL4和15-LOX表达增加;氧化态的BODIPY 581/591 C11表达增加;且bEnd.3细胞ZO-1的表达量也大量减少。用Lip-1和RSL3联合干预bEnd.3细胞,结果发现细胞中GSH含量升高、GPX4含量也明显增加、ACSL4和15-LOX表达降低、还原态的BODIPY 581/591 C11大量增加,最重要的是,细胞表达的ZO-1明显增多。3.Lip-1抑制大鼠脊髓损伤后血管内皮细胞的铁死亡损伤后3天,脊髓selleck NMR组织免疫荧光染色结果显示SCI组RECA1与ACSL4、15-LOX的共定位较Sham组增高,即血管内皮细胞表达的ACSL4和15-LOX在损伤后3天升高。给予Lip-1治疗后,RECA1与ACSL4、Medical Help15-LOX的共定位减少,即Lip-1可以降低血管内皮细胞中ACSL4和15-LOX的水平。4.Lip-1减轻脊髓损伤后巨噬细胞和中性粒细胞的浸润组织免疫荧光显示脊髓损伤后7天CD68荧光强度增加,损伤后3天MPO荧光强度增加。而Lip-1组组织中CD68和MPO的荧光强度明显比SCI组弱,表明Lip-1可以抑制损伤后脊髓组织中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润。5.Lip-1减少胶质瘢痕的产生并增加脊髓损伤后神经元的存活数量损伤后8周大鼠脊髓的免疫荧光结果显示,SCI组损伤边缘GFAP阳性的荧光强度明显比Sham组高,表明损伤后8周有大量胶质瘢痕产生。Lip-1治疗后,GFAP阳性的荧光强度降低,即Lip-1可以减少损伤后8周脊髓组织中的胶质瘢痕。此外,Lip-1组损伤周围区域NeuN阳性的细胞数量比SCI组显著增加,表明Lip-1可以增加损伤后脊髓中的神经元数量。6.Lip-1可以促进大鼠脊髓损伤的功能恢复大鼠脊髓损伤后8周的H&E染色结果显示,Lip-1组的大鼠比SCI组保留更多的脊髓组织。BBB评分结果显示,Lip-1组的分数比SCI组升高,差异具有统计学意义。CatWalk步态分析的足印结果可以看出,Lip-1组大鼠的双后肢足印明显较SCI组清晰、完整,即双后肢有较好的恢复。电生理检测结果显示,Lip-1组运动诱发电位和感觉诱发电位的潜伏期较SCI组短、波幅较SCI组高。以上结果表明,Lip-1可以有效改善脊髓损伤后大鼠的功能恢复。研究结论1.铁死亡抑制剂Lip-1减轻血脊髓屏障的继发性破坏,减少外周炎症细胞浸润,降低脊髓损伤继发性损伤介导的微环境失衡。2.铁死亡抑制剂Lip-1通过脂质过氧化途径抑制血管内皮细胞铁死亡,稳定血脊髓屏障结构。3.铁死亡抑制剂Lip-1可以有效地抑制胶质瘢痕生成,保护残存神经元,修复脊髓损伤后大鼠的运动功能和神经传导功能。