第一部分:单细胞水平解析ITP中骨髓造血干祖细胞的转录组改变研究背景:原发免疫性血小板减少症(ITP)是一种获得性自身免疫性疾病,以无明确诱因的孤立性外周血血小板计数减少和出血风险增加为主要特点,是临床上最常见的出血性疾病。ITP的主要发病机制已被广泛研究,普遍认为是免疫介导的血小板破坏增加和血小板生成减少。血小板生成是一个复杂的生物过程,涉及到造血干细胞向巨核细胞谱系的定向分化、巨核细胞成熟和血小板释放。此前,包含我们课题组在内的多个团队报道了抗血小板自身抗体、骨髓CD8+T细胞、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)损害ITP的巨核细胞生成。最近,Herd等报道了小鼠ITP模型中长期造血干细胞(LT-HSC)的体外激活和增殖水平升高。然而,造血分化是否以及如何参与ITP的发病机制尚不清楚。一方面,血小板的减少和免疫细胞的消耗激活骨髓造血,另一方面,造血干祖细胞(HSPCs)本身可能是自身免疫攻击的目标,因为目标抗原既存在于血小板上,也存在于较不成熟的造血祖细胞上。此外,不同骨髓HSPCs亚群间的细胞串扰可能在诱导巨核生成缺陷中发挥关键作用,ITP中HSPCs间潜在的相互作用仍然是一个亟待深入研究领域。因此,我们提出“ITP骨髓中HSPCs亚群存在异常,导致巨核细胞生成缺陷,血小板生成减少,针对骨髓HSPCs的检查和干预可能成为ITP诊断和治疗的新靶点”的假说。HSPCs具有高度异质性。单细胞技术,特别是转录组测序及其相关生物信息分析策略的进步,使得直接研究异质性细胞群体更加便捷,具有传统实验方法无法比拟的优势。近年来,单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术在研究干细胞分化、胚胎发育、肿瘤免疫等方面的研究中都发挥了重要作用。然而,目前仍然没有ITP病理状态下骨髓HSPCs的scRNA-seq的相关报道。在单细胞水平解析骨髓HSPCs转录组学改变,鉴定潜在的致病细胞亚群及分子调控机制,对ITP发病机制的研究十分必要。研究目的:(1)绘制ITP患者骨髓HSPCs单细胞转录组图谱。(2)探索ITP患者骨髓HSPCs单细胞转录组改变。(3)筛选、验证参与巨核细胞生成缺陷的关键骨髓HSPCs亚群和分子机制。研究方法:(1)临床样本采集:采集未经治疗的新诊断ITP患者和健康志愿者的髂骨骨髓液标本。(2)单细胞转录组文库制备及测序:使用流式细胞分选技术分选骨髓CD34+HSPCs,基于10x Genomics平台进行单细胞3’端转录组建库,测序使用Illumina NovaSeq 6000。(3)单细胞转录组数据处理:下机数据使用bcl2fastq进行拆分,Cell Ranger进行参考基因组比对、基因表达水平定量。使用 Seurat、Harmony、ClusterProfiler、GSEA、pySCENIC、Monocle2、Scanpy、CellPhoneDB等工具进行下游分析,以查找ITP骨髓CD34+HSPCs在细胞亚型、基因表达、分化轨迹、转录调控网络、细胞互作等方面的差异。(4)抗体和流式细胞术:细胞表面和核内标记物染色按照说明书进行。采用Kaluza analysis软件进行分析。(5)细胞离体培养和形态观察:使用添加多谱系细胞因子和血清替代物的StemSpan SFEM Ⅱ培养基培养 CD9+Lin-CD34+CD45RA-细胞、CD9-Lin-CD34+CD45RA-细胞、Lin-CD34+CD45RA+CD3 8+CD9+CD10+细胞和 Lin-CD34+CD45RA+CD3 8+CD161+细胞。在37℃、5%二氧化碳的恒温加湿培养箱中培养。细胞形态使用普通光学显微镜、免疫荧光显微镜观察。(6)统计分析:在R软件中使用卡方(χ2)检验、双尾学生t检验、变量转换和方差分析(ANOVA),以及Scheffe事后检验来进行比较分析。研究结果:(1)ITP患者和健康对照组(HC)骨髓CD34+HSPCs的单细胞转录组图谱经过质量控制和批BAY 73-4506纯度次效应校正后,共计纳入56,312(ITP,n=28,507;HC,n=27,805)个细胞至下游数据分析中,这些细胞进一步被鉴定为15个基因表达模式不同的细胞亚群。包括1个造血干细胞亚群(HSC),1个多能祖细胞亚群(MPP),1个粒细胞-巨噬细胞祖细胞亚群(GMP),1个中性粒细胞祖细胞亚群(NeuP),1个单核细胞-树突细胞祖细胞亚群(MDP),1个嗜酸性粒细胞-嗜碱性粒细胞-肥大细胞祖细胞亚群(EBMP),1个共同淋巴样祖细胞亚群(CLP),3个前B细胞亚群(preB1,preB2和preB3),1个自然杀伤细胞/T细胞祖细胞亚群(NK/Tp),1个巨核细胞-红细胞祖细胞亚群(MEP),2个巨核细胞祖细胞亚群(MkP1和MkP2),1个红细胞祖细胞亚群(EryP)。拟时分析显示ITP组和HC组的骨髓CD34+HSPCs具有相似的分化轨迹,但在转录组尤其是免疫相关基因的表达水平上存在显著差异,这提示在揭露ITP的发病机制时应考虑HSPCs的免疫相互作用。进一步地分析显示两组的巨核细胞/红细胞(Mk/Ery)谱系细胞沿伪时间的分布并不完全一致,这一结果提示与HC组相比,ITP组HSPCs的分化潜能,特别是向巨核细胞和(或)红细胞分化的潜能可能存在异常。(2)ITP中骨髓CD34+HSPCAirborne infection spreads的转录组改变我们评估了 ITP组在每一个亚群中的转录组改变,总共得到1,166个差异表达基因(DEGs),其中,33.28%的DEGs发生在preB3和NK/Tp这两个亚群,这提示免疫细胞在ITP的发病机制中发挥重要作用。进一步分析显示独特的配体-受体相互作用和转录调控网络的失调可能在这一过程中发挥重要作用。(3)HES1和CD9在ITP中表达下调DEG分析的结果显示,在MkP1中,ITP组最显著上调的基因包括HBB、HBG2和AHSP,它们都与红细胞生成相关;而在MkP2中,ITP组最显著下调的基因包括CD9和TUBB1,它们都与血小板生成相关。这提示在ITP骨髓中巨核细胞生成过程可能存在缺陷。因此,我们聚焦于影响分化潜能的DEGs,并选择HES1和CD9进行进一步验证。多参数流式细胞术实验的结果显示,ITP中HES1+细胞和CD9+细胞的数量显著减少,与单细胞转录组数据的分析结果一致。(4)CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs在体外具有巨核细胞生成倾向,并在ITP中存在显著缺陷细胞离体培养实验表明,CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs具有向巨核细胞分化的趋势,但这种趋势在ITP中没有观察到,培养体系中反而产生了更多的红细胞。在HC组中,CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs培养体系中分化产生的巨核细胞的比例约比CD9-Lin-CD34+CD45RA-HSPCs 的高 3 倍,而在 ITP 组中,CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs培养体系中分化产生的巨核细胞的比例下降到HC组的 1/4,与CD9-Lin-CD34+CD45RA-HSPCs的基本相当,这些结果表明ITP中CD9+HSPCs向巨核细胞分化的过程存在异常,细胞分化潜能可能受损。此外,我们证明CD9可用于富集具有巨核细胞分化偏倚的HSPCs,而且CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs有可能成为ITP诊断和治疗新靶点。(5)与ITP来源的pre-B细胞共培养显著降低了 CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs后代中巨核细胞的比例分选ITP患者和健康志愿者的骨髓pre-B细胞,分别与健康志愿者的骨髓CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs进行Transwell细胞共培养,结果显示ITP来源的pre-B细胞使CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs后代中巨核细胞的比例显著下降,提示ITP中的骨髓巨核细胞生成缺陷可能与异常的pre-B细胞相关。(6)MkP的细胞异质性及ITP中MkP亚群的转录组变化对ITP和HC所有样本中的MkP(MkP1和MkP2)细胞进行汇集和再分类分析,我们发现MkP可以进一步地分为7个具有不同基因表达模式和功能的亚群。ITP相关的DEGs具有MkP亚型特异性,其中98.5%的上调基因和82.4%的下调基因集中在1个具有免疫调节和血小板生成双重功能的亚群中,这提示在MkP中,该亚群与ITP发病机制最具相关性。在该亚群中,与血小板生成相关的基因,例如GP9、PF4、CD9、PPBP等,表达是显著下调的,而与红细胞生成相关的基因,例如HBB、HBD、CA1、AHSP等,表达则是显著上调的,这与前述MkP1和MkP2的分析结果一致。富集分析结果显示,该亚群血小板活化和细胞免疫通路显著下调,RNA剪接和HSC分化调控显著上调研究结论:通过本研究,我们提供了一个全面的骨髓CD34+HSPCs单细胞转录组图谱来描述未经治疗的新诊断ITP患者的转录组改变。我们的分析显示,ITP骨髓中存在一个独特的免疫生态系统,其特征是造血过程中免疫相关基因和通路的增强,pre-B和NK/Tp亚群中大量的转录组改变,HSPCs亚群间免疫串扰的激活,以及MkP亚群中伴随血小板生成潜能下调的免疫调节功能减弱。功能试验结果表明,ITP患者Lin-CD34+CD45RA-HSPCs中HES1+细胞和CD9+细胞数量均减少,CD9+Lin-CD34+CD45RA-HSPCs的巨核细胞分化潜能受损,而这一损伤可能与异常的pre-B细胞相关。我们在单细胞水平解析了 ITP患者骨髓CD34+HSPCs的异质性和疾病特征,为ITP研究提供了新的病理生理学见解和潜在治疗靶点。第二部分:HDAC3 rs2530223单核苷酸多态性与ITP易感性和严重程度增加相关研究背景:原发免疫性血小板减少症(ITP)是一种获得性自身免疫性出血性疾病,定义为血小板计数<100×109/L且无其他原因引起的血小板减少症。ITP是临床上最常见的出血性疾病,约占所有出血性事件的30%,在成人中常表现为慢性疾病。普遍认为体液免疫和细胞免疫参与了其发病过程,包括T细胞的异常分化和应答,以及浆细胞分泌抗巨核细胞和血小板的自身抗体。使用糖皮质激素和其他药物治疗ITP仍有约50%的患者治疗无效或在短期内复发。因此,有必要进一步探讨ITP的危险因素,以确定新的潜在治疗靶点。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)超家族在哺乳动物中由基因组编码的11个HDAC亚型组成。我们以前报道过,低剂量的西达本胺可以恢复ITP患者的免疫耐受,而西达本胺是一种选择性HDAC抑制剂。在成年哺乳动物中,HDAC3在应对环境挑战、调控昼夜节律、调节营养与代谢途径、限制自身免疫、维持体内稳态等方面都发挥作用。HDAC3通过系统性免疫反应调节免疫功能、影响细胞稳态,从而调节自身免疫和炎症反应。例如,HDAC3是介导炎症巨噬细胞免疫耐受和反应的一个很有价值的蛋白质靶标,巨噬细胞中HDAC3的缺失表现出抗炎组蛋白乙酰化基因表达模式,具有抗炎症的保护作用。T细胞的HDAC3缺失会阻碍其向双阳性阶段的转变,并表现出T细胞功能和细胞周期相关基因的表达水平下调。此外,调节性T细胞(Treg)中的HDAC3缺乏会扰乱免疫抑制性Treg的HDAC3依赖性功能,从而导致炎症性肠病(IBD)和其他致命的自身免疫病。因此,HDAC3作为一个动态染色质调节因子调控自身免疫,其在ITP中的作用还有待进一步阐明。遗传学研究表明许多遗传变异,尤其是单核苷酸多态性(SNP)与自身免疫性疾病有关。已有研究表明HDAC3rs2530223与糖尿病及肿瘤免疫有关。考虑到HDAC3在免疫调节中发挥重要功能,我们假设HDAC3多态性在ITP发病机制中有重要作用。研究目的:探究HDAC3 rs2530223多态性与中国汉族人群ITP易感性、严重程度以及治疗反应之间的关系。研究方法:(1)临床样本采集:收集ITP患者的临床资料和外周静脉血样本,并根据外周血血小板计数、皮质类固醇敏感性、难治性进行分层。收集年龄、性别匹配的健康志愿者的外周静脉血样本作为对照组。所有参与者都属于汉族人群。(2)HDAC3基因多态性测定:分离ITP患者和健康志愿者样本中的外周血单个核细胞(PBMC)并提取其基因组DNA。利用MassARRAY平台对HDAC3 rs2530223多态性进行基因分型。(3)统计分析:对对照组HDAC3 rs2530223基因型进行哈迪-温伯格平衡定律(LEE011小鼠HWE)检验。数据统计分析使用SPSS 26.0软件进行,统计方法为卡方(χ2)检验、Fisher精确检验和二元单因素Logistic回归分析。研究结果:(1)研究对象共计招募到209例ITP患者和210例健康志愿者,两组在年龄、性别上无显著性差异(P值分别为0.25和0.25)。ITP患者中,血小板计数<30×109/L的占75.60%(n=158),难治性的占6.22%(n=13),使用皮质类固醇治疗的占80.86%(n=169),其中86例发生皮质类固醇抵抗。健康对照组的HDAC3 SNP rs2530223符合HWE(P=0.41)。(2)HDAC3基因多态性与ITP易感性的关系在隐性、显性、共显性和等位基因模型中,HDAC3rs2530223的基因型频率和等位基因频率与ITP易感性显著相关(P值分别为0.036、0.033、0.035和0.009)。T等位基因使 ITP 易感性增加 1.472 倍(OR 1.472;95%CI 1.100-1.969;P=0.009)。共显性和隐性模型中TT基因型以及显性模型下TC/TT基因型的ITP易感性均显著增加(共显性模型:OR 2.264,95%CI 1.175-4.360,P=0.015;隐性模型:OR 1.512,95%CI 1.028-2.224,P=0.036;显性模型:OR 1.965,95%CI 1.046-3.656,P=0.036)。(3)HDAC3基因多态性与血小板计数的关系将ITP患者分为血小板计数<30×109/L(n=158)和血小板计数≥30×109/L(n=51)两组,在显性和共显性模型中,HDAC3rs2530223基因型频率在两组间存在差异,提示ITP患者HDAC3rs2530223基因型频率与血小板计数具有显著相关性(P值分别为0.008和0.030),而在隐性和等位基因模型下差异无统计学意义(P值分别为0.448和0.068)。在共显性和显性模型中,TC/TT基因型与血小板计数<30×109/L的风险增加相关(OR 3.932;95%CI 1.426-10.842;P=0.008)。(4)HDAC3基因多态性与皮质类固醇敏感性的关系将接受皮质类固醇治疗的ITP患者分为皮质类固醇敏感组(n=83)和皮质类固醇抵抗组(n=86),HDAC3rs2530223的基因型频率和等位基因频率在这两组间没有显著性差异(隐性模型:P=0.494;显性模型:P=0.169;共显性模型:P=0.110;等位基因模型:P=0.968)。(5)HDAC3基因多态性与ITP难治性的关系将对药物治疗和脾切除术有反应的ITP患者归为非难治性组(n=196),其他ITP患者归为难治性组(n=13),HDAC3rs2530223的基因型频率和等位基因频率在这两组间没有显著性差异(隐性模型:P=0.871;显性模型:P=0.606;共显性模型:P=0.753;等位基因模型:P=0.547)。研究结论:我们发现HDAC3 rs2530223单核苷酸多态性与ITP易感性和严重程度增加相关,与ITP难治性或皮质类固醇敏感性无关。HDAC3可能参与了 ITP的分子发病机制。