【目的】肝内胆管癌(ICCA)是仅次于肝细胞癌的肝脏中第二大最常见的原发性恶性肿瘤,占所有肝脏恶性肿瘤的20%,占所有胃肠道恶性肿瘤的3%。ICCA的主要特征之一是高度恶性和低血荷的无肿瘤性基质,并积累了α-SMA阳性表达的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs),同时沉积了细胞外基质相关蛋白,如透明质酸和其他蛋白聚糖。ICCA的促纤维增生特性被认为会导致预后不良和耐药性。临床研究发现CAFs的积累同肿瘤生长和预后不良之间呈正相关。因此,研究CAFs的分子机制并进行靶向调控,可能成为ICCA新的治疗方向。本研究的目的是探索硫酸乙酰肝素-6-O-硫酰基转移酶1(HS6ST1)介导CAFs在体内外的肝内胆管癌进展中的作用。【方法】(1)肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)及正常成纤维细胞(NFs)分别从人类肝内胆管癌组织和癌旁组织中使用胰酶消化法进行分离。使用形态评估,免疫荧光来鉴定分离的CAFs和NFs表征。通过CCK8法检测CAFs对于ICCA的细胞增殖能力的影响;通过划痕实验检测CAFs对于ICCA的细胞迁移能力的影响;通过Transwell细胞小室实验检测CAFs对于ICCA的细胞侵袭能力的影响。采用高通量RNA测序了解CAFs和NFs的表达谱差异,并确定后续实验研究的靶标。(2)利用ICCA免疫组化芯片,采用HS6ST1和α-SMA免疫组化染色,检测HS6ST1在ICCA组织和CAFs中的表达情况;采用卡方检验对HS6ST1同临床指标间的相互关系进行分析;采取Kaplan-Meier方法分析HS6ST1的表达和ICCA患者预后之间的关系。(3)合成HS6ST1质粒转染至CAFs中,收集培养上清,获得了CAFs-CM、CAFs ~(NC)-CM和CAFs ~(HS6ST1)-CM。利用培养上清处理ICCA细胞株,48h后,通过CCK8法检测不同CAFs-CM对于ICCA细胞增殖能力的影响;通过划痕实验检测不同CAFs-CM对于ICCA细胞迁移能力的影响;通过Transwell细胞小室实验检测不同CAFs-CM对于ICCA细胞侵袭能力的影响。(4)通过免疫荧光检测CAFs-CM对于ICCA细胞侵袭性伪足形成能力的影响;通过G-LISA检测相关标志物Rho-A、Rac-1 GTP和Cdc-42 GTP水平的变化;通过蛋白印迹和明胶酶谱实验分别检测ECM相关标志物MMP家族变化。(5)皮下注射5×10~6个RBE细胞/只构建裸鼠荷瘤模型,同时瘤体多点局部注射不同CAFs-CM;每3天游标卡尺测量肿瘤大小;28天后处死裸鼠,剥离肿瘤,测量肿瘤体积及重量。免疫组化检测瘤体中Ki67的表达情况。(6)通过ELISA方法比较不同CAFs中FGF2和PDGF的分泌水平;通过q PCR和Western Blot比较不同CAFs中FGF2和PDGF的表达水平,比较不同CAFs-CM处理的RBE细胞中FGFR1、PDGFRβ、PI3K/AKT/ERK信号通路的表达水平;通过免疫组化比较不同CAFs-CM处理组瘤体中FGFR1、PDGMicrobubble-mediated drug deliveryFRβ和CD31的表达情况。【结果】(1)正常胆管和胆管癌组织之间的免疫组织化学存在差异:α-SMA,FSP-1,FAP和PDGFR-β的表达在癌细胞周围的CAFs中阳性染色。在NFs中,α-SMA,FSP-1,FAP和PDGFR-β阴性染色。CAFs被成功分离,其具有不规则的纺锤形或星状样形态,并逐渐形成了网络的结构;NFs呈现常规的短纺锤形。免疫荧光显示NFs和CAFs都表达了间充质细胞标记波形蛋白;CAFs中的α-SMA、FSP-1,FAP和PDGFR-β水平高于NFs。而VEGFα在CAFs和NFs之中的表达没有差异。相对于NFs-CM,CAFs-CM促进了ICCA细胞增殖(195.3±12.9%)和运动性增强(134.9±6.5%)。RNA测序显示CAFs和NFs之间的265个差异基因,多富集于细胞外基质,细胞迁移的阳性调节,血管生成等的阳性调节等信号通路上。(2)HS6ST1在ICCA组织中的表达同年龄,性别,组织学等级,TNM分期和肿瘤大小无统计学相关性。HS6ST1的表达同ICCA的预后无相关性。HS6ST1在CAFs中的表达同淋巴结转移(P=0.004)和组织学等级(P=0.030)呈负相关。在CAFs中的高表达HS6ST1患者的总生存率明显高于低表达患者(P=0.005)。(3)HS6ST1过表达对CAFs和ICCA本身增殖无影响。寻找更多相较于CAFs-CM,CAFs ~(HS6ST1)-CM处理后ICCA细胞株迁移能力下降(43.2±5.6%),侵袭能力也受到抑制(39.6±9.7%)。(4)相较于CAFs-CM,CAFs ~(HS6ST1)-CM处理后RBE细胞的伪足形成数量和形态明显降低;相关标志性因子RHO-A和CDC-42的水平也明显下调,但RAC-1水平无变化;CAFs ~(HS6ST1)-CM处理后RBE细胞的MT1-MMP表达显著下调;MMP9的水平也降低。(5)使用RBE细胞建立的ICCA裸鼠模型中,与对照组相比,NFs-CM局部多点注射并未促进肿瘤的生长(824±89mm~3vs.748±71mm~3);然而,CAFs-CM的注射增加了肿瘤生长速度(1260±180mm~3)。与CAFs ~(NC)-CM相比,CAFs ~(HS6ST1)-CM的注射抑制了肿瘤的生长(842±124 mm~3vs.1180±243 mm~3)。CAFs ~(HS6ST1)-CM组中ki67染色阳性细胞数量明显降低(P<0.05),但HS6ST1表达明显上调。(6)同NFs比较,CAFs ~(NC)分泌的FGF2和PDGF水平明显上调;同CAFs ~(NC)比较,CAFs ~(HS6ST1)分泌的FGF和PDGF水平明显降低。q PCR和Western Blot结果同ELISA相一致。KD025在RBE细胞中,CAFs ~(NC)-CM上调了FGFR1、PDGFRβ、PI3K/AKT/ERK信号通路的表达水平,而CAFs ~(HS6ST1)-CM对这些因子具有抑制作用。瘤体组织标本的免疫组织化学分析显示,CAFs ~(NC)-CM组FGFR1、PDGFRβ蛋白的高表达,但在CAFs ~(HS6ST1)-CM组中低表达。而CD31在各个组瘤体中的表达情况基本一致。【结论】本研究表明,CAFs在ICCA肿瘤微环境中发挥了促进作用,通过HS6ST1靶向CAFs,对于ICCA在体内外显著抑制ICCA的生长、迁移和侵袭及肿瘤细胞的运动能力。HS6ST1的机制可能同CAFs分泌的FGF2-FGFR1和PDGF-PDGFRβ轴激活的下游PI3K/AKT/ERK信号通路相关。CAFs可作为新型ICCA治疗策略。