H5亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)主要在亚洲、非洲和欧洲等地区流行。在过去的十年间以clade 2.3.4.4为代表的H5N6和clade 2.3.2.1为代表的H5N1亚型AIV在亚洲各国广泛流行,并给当地的家禽养殖业造成了巨大的经济损失。在亚洲以中国为首的国家开始采用疫苗免疫政策防控H5亚型AIV,其中针对clade 2.3.4 HZ-IETD-FMK体内实验剂量5使用的疫苗依次为Re-5、Re-8和Re-11,针对clade 2.3.2.1H5使用的疫苗依次为Re-6、Re-10和Re-12。随着中国疫苗防控H5亚型AIV取得了巨大的成效,孟加拉国和越南等东南亚国家相继引进了部分中国疫苗。疫苗抗体压会驱动流感病毒的进化,血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)作为两种流感病毒表面蛋白则首当其冲受到抗体压的筛选。除了氨基酸突变,HA和NA还可以通过改变糖基化修饰来适应抗体压力。本研究以流行病学为基础,发掘HA和NA上糖基化的变化,以clade2.3.4.4H5N6亚型AIV(B、W和HJ株)以及clade2.3.2.1 H5N1亚型AIV(DT和YZ株)为模型,利用反向遗传技术删除或添加糖基化,以探究HA/NA蛋白糖基化对H5亚型AIV生物学特性、致病性和抗原性的影响。不仅如此,HA的糖基化水平还会影响H5亚型AIV与C型凝集素受体的结合,本研究使用构建的HA糖基化突变表型以及实验室前期构建的HA糖基化表型 clade2.3.4H5N1 亚型 AIV(SY 株)为模型,探索了 DC/L-SIGN 和 LSECtin 凝集素受体识别不同H5亚型AIV HA糖基化病毒的差异。1.HA蛋白63和129位糖基化位点对H5N6亚型禽流感病毒生物学特性及抗原性的影响对全球范围内H5N6亚型AIV HA蛋白63(HA-63)和129(HA-129)位糖基化的毒株数量、出现时间以及地域分布进行分析。以B(clade2.3.4.4e,WT-HA-63-129-)和W(clade2.3.4.4h,WT-HA-63+129+)株为母本毒株分别添加或删除HA-63和HA-129位糖基化位点,并测定了糖基化突变病毒的生物学特性及抗原性。结果显示,含有HA-129位糖基化位点的H5N6亚型AIV出现在clade 2.3.4.4d以及clade 2.3.4.4h中,最早在中国出现并成为流行株;而含HA-63位糖基化位点的H5N6亚型AIV仅出现在clade 2.3.4.4h中。含有HA-129位糖基化位点的H5N6亚型AIV增强了 HA蛋白的热稳定性。进一步试验表明,rB在获得HA-129位糖基化位点后逃逸了 Re-8血清的中和能力,而rW在缺失HA-129位糖基化位点后可以被Re-8血清完全中和,且商品化的Re-11血清中含有针对HA-129位糖基化位点的抗体。综上所述,含HA-129位糖基化的H5N6亚型AIV逃逸了 Re-8疫苗的免疫抗体压力,从而在中国家禽中形成了免疫适应株。2.HA蛋白129位和NA蛋白86位糖基化位点共同进化对clade 2.3.4.4 H5N6亚型禽流感病毒生物学特性的影响对中国境内的H5N6亚型AIV的HA蛋白129位(HA-129)和NA蛋白86(NA-86)位糖基化位点的演化情况进行了联合分析。以HJ(clade2.3.4.4f,WT-HA129-NA86+)为母本毒株分别添加HA-129和去除NA-86位糖基化位点,同时以W(clade 2.3.4.4h,WT-HA129+NA86-)为母本毒株分别去除HA-129和添加NA-86位糖基化位点,测定了糖基化突变病毒的生物学特性。结果显示,H5N6亚型AIV新增HA-129位糖基化位点与缺失NA-86位糖基化位点在流行病学上高度联系,并广泛发生在clade 2.3.4.4h中。而NA-86位糖基化在H6N6亚型禽流感中仍旧保守,其缺失是H5亚型特异的。含HA-129 位糖基化的 H5N6 亚型 AIV 稳定了病毒与 α-2,3 和 α-2,6 唾液酸受体的结合,同时添加HA-129位糖基化位点增加了 HJ结合α-2,3唾液酸受体的能力。添加HA-129位和缺失NA-86位糖基化位点都减弱了病毒的神经氨酸酶活性。动物试验结果显示:相较于野生型病毒,添加HA-129位糖基化位点增加了 H5N6亚型AIV对鸡和小鼠的致病性,而去除NA-86位糖基化位点减弱了病毒对鸡和小鼠的致病性。综上所述,H5N6亚型AIV在抗体选择压下发生了添加HA-129位糖基化位点和缺失NA-86位糖基化位点的共同进化,提升了病毒对鸡和小鼠的致病性。3.HA蛋白158位和NA蛋白88位糖基化位点共同进化对clade 2.3.2.1 H5N1亚型禽流感病毒抗原性和致病性的影响对全球H5N1亚型AIV的HA蛋白158位(HA-158)和NA蛋白88(NA-88)位糖基化位点的演化情况进行了联合分析。以YZ(clade 2.3.2.1d,WT-HA158-NA88+)为母本毒株分别添加HA-158和缺失NA-88位糖基化位点,同时以DT(clade2.3.2.1e,WT-HA158+NA88-)为母本毒株分别去除HA-158和添加NA-88位糖基化位点,测定了糖基化突变病毒的生物学特性。结果显示,clade 2.3.2.1 H5N1亚型AIV的HA-158位糖基化位点的新增和NA-88位糖基化位点的缺失发生在中国和孟加拉国,且二者的变化从时间到地域上都与Re-6疫苗的使用高度相关。血凝抑制和微中和试验结果显示clade 2.3.2.1e的DT毒株在缺失HA-158位糖基化位点后会被Re-6疫苗血清完全中和。相较于野生型病毒,添加HA-158位糖基化位点提升了 H5N1亚型AIV的神经氨酸酶活性和病毒对家禽和小鼠的致病性,而缺失NA-88位糖基化位点则削弱了神经氨酸酶活性和致病性。综上所述,HA-158位糖基化位点使H5N1亚型AIV获得了逃逸Re-6疫苗免疫抗体压的能力,所产生的HA158+NA88-糖基化模式提升了病毒对鸡和小鼠的致病性。4.C型凝集素受体DC/L-SIGN和LSECtin在识别H5不同HA糖基化位点病毒的功能初探为了探究凝集素受体对HA不同糖基化水平H5亚型AIV的识别差异,通过ELISA试验测定了 C型凝集素受体蛋白DC/L-SIGN和LSECtin与clade2.3.4.4的H确认细节5N6(rW-HA129+NA86-和 rW-HA129-NA86-)、clade2.3.2.1的H5N1(YZ-HA158+NA88-和 YZ-HA158-NA88-)和 clade2.3.4 的 H5N1(rS-144-/158+/169+、rS-144-/158-/169+和rS-144-/158+/169-)不同糖基化突变病毒的结合能力,并以糖基化突变病毒感染唾液酸受体抑制的分别稳定表达DC/L-SIGN和LSECtin的A549细胞。ELISA结果显示,rS-144-/158-/169+和rS-144-/158+/169-可以更好的结合DC/L-SIGN和LSECtin。而在唾液酸受体被抑制后,在A549细胞中DC/L-SIGN和LSECtin的表达都促进了 H5亚型AIV的感染。LSECtin的基因敲除小鼠结果显示,与野生株rS相比,低糖基化水平的缺失株(rS-144-/158-/169+和rS-144-/158+/169-)造成了 LSECtin基因敲除小鼠更严重的感染,同时HA头部缺乏糖基化位点的PR8也观察到了小鼠死亡率的上升。综上所述,DC/L-SIGN和LSECtin在A549上皮细胞中表达能促进H5亚型AIV的复制,体内试验表明LSECtin基因敲除后,H5亚型AIV糖基化位点缺失突变株和PR8这类HA低糖基化水平的流感病毒提升了其对小鼠的致病性。因此,在抗体选择压下H5N6和H5N1亚型speech-language pathologistAIV分别获得了 HA-129位和HA-158位糖基化位点,并共同进化,分别缺失NA-86位和NA-88位糖基化位点,提升了 H5亚型AIV对家禽和小鼠的致病性。LSECtin受体介导了含HA不同糖基化修饰水平的H5亚型AIV对小鼠致病性。