H9N2亚型禽流感是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)感染禽类后引起的对呼吸道和消化道系统造成损害、产蛋量下降或免疫抑制为主的传染病。本研究对H9N2亚型禽流感病毒流行毒株进行分离鉴定,通过MDCK细胞悬浮培Blebbistatin养后进行毒力及免疫原性测定,主要研究结果如下。对疑似感染禽流感的发病鸡采集咽拭子及泄殖腔拭子,提取RNA进行RT-PCR检测。将阳性样品的咽拭子和泄殖腔拭子上清液接种到10日龄SPF鸡胚,收集的尿囊液经有限稀释法纯化3轮后,取红细胞凝集价最高的鸡胚尿囊液在鸡胚上扩大培养后进行病毒含量测定、RT-PCR鉴定、红细胞凝集价测定和特异性鉴定。实验结果显示,病毒含量测定为10~(8.32)EID_(50)/0.1m L,透射电镜观察,该病毒为囊膜病毒,呈球形,直径约为80～120 nm。特异性鉴定结果确定为H9亚型禽流感病毒,该病毒命名为A/Chicken/Hu Nan/20/2020(H9N2),简称Hu N20株。对纯化病毒进行纯净性检验表明Hu N20株无菌、无支原体和外源病毒污染。对禽流感病毒Hu N20株HA基因和NA基因与国内近几年分离株进行同源性比对和遗传进化分析,Hu N20株的HA基因与NA基因均属于Y280-like亚系。Hu N20株对SPF鸡的致病性实验,测定了感染鸡的排毒情况和最小感染剂量。结果表明,感染Hu N20株后1～7d均可检测到咽喉和泄殖腔排毒;对42日龄SPF鸡的最小感染剂量为10~(5.0)EID_(50)/0.1m L。对病毒培养与灭活工艺进行了探索,采用MDCK细胞悬浮培养,细胞密度为3×10~6～4×10~6cellshepatitis-B virus/m L时,0.1%的剂量接种病毒,添加胰酶浓度为60μg/m L,病毒红细胞凝集价最高可达到11 log_2。病毒灭活实验显示,甲醛终浓度为0.1%、0.2%和0.05%灭活4小时,0.01%灭活8小时,病毒液中病Dinaciclib化学结构毒被全部灭活。免疫效力实验结果显示,免疫后7d鸡血清的HI抗体效价的几何平均值为2.9 log_2,免疫后14d鸡血清的HI抗体效价的几何平均值为10.5 log_2,免疫后21 d鸡血清的HI抗体效价的几何平均值为11.5 log_2。SPF鸡免疫21 d后的攻毒保护率为100%,表明用MDCK细胞悬浮培养Hu N20株制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性。采用抗原含量不同的灭活病毒液制备灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡后21 d测定免疫鸡血清HI抗体效价,并同时对免疫后的鸡进行攻毒,结果表明,抗原含量不低于10~(6.5)EID_(50)/0.1m L时,制备的灭活疫苗免疫鸡血清的HI抗体效价几何平均值在9.8 log_2以上,免疫鸡的攻毒保护率均为100%,确定制备疫苗的最小抗原含量不低于10~(6.5)EID_(50)/0.1m L。以Hu N20株和商品用HZ疫苗株分别制成灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡,在免疫后7d、14 d、21 d时用两种抗原进行交叉HI抗体效价测定。结果表明:以Hu N20株做HI试验抗原时,Hu N20株疫苗免疫后21d鸡血清HI抗体效价几何平均值为11.5 log_2,HZ株疫苗免疫后21 d鸡血清HI抗体效价几何平均值为7.8 log_2,以HZ株做HI试验抗原时,Hu N20株疫苗免疫后21 d鸡血清HI抗体效价几何平均值为9.8 log_2,HZ株疫苗免疫后21 d鸡血清HI抗体效价几何平均值为11.0 log_2。用Hu N20株分别对两组免疫鸡进行静脉攻毒,Hu N20株疫苗免疫鸡的攻毒保护率为100%,HZ株疫苗免疫鸡的攻毒保护率为80%,对照鸡100%病毒分离阳性,HZ株疫苗免疫鸡不能100%抵御流行毒株Hu N20株的攻击。综上所述,本研究对疑似禽流感病毒感染鸡的病料进行病毒分离、鉴定和纯化分析后,确定分离出一株H9N2亚型的禽流感病毒。该毒株在MDCK悬浮细胞中繁殖具有良好的免疫原性,可以使免疫鸡抵御Hu N20株攻击,免疫保护率为100%。本研究为H9N2亚型禽流感疫苗的研发和采用MDCK悬浮细胞大规模生产禽流感病毒奠定了基础,也为其他病毒类疫苗的规模化生产提供了参考。