研究背景:骨质疏松是一种以骨量降低和骨微环境破坏为主要特征的全身性骨代谢疾病。在骨质疏松症患病群体中,女性群体所占比例高达70%。由于绝经引发的雌激素水平的降低,是女性患骨质疏松症的主要因素。普遍认为规律运动能够改善骨重塑进程,提高机体的骨密度及骨量。破骨细胞主导的骨吸收是骨重塑进程的重要环节,对骨量的调控起到关键的作用。但是运动在调控破骨细胞介导的骨吸收进程中的具体机制,目前尚不清楚。研究发现G蛋白偶联受体81(G protein-coupled receptor 81,GPR81)在调控破骨细胞分化和功能中发挥重要作用,而且乳酸是GPR81的唯一内源性的配体。由此提出我们的研究假设:运动产生的乳酸,通过循环系统作用于破骨细胞膜上的受体GPR81,进而调控破骨细胞的功能和骨吸收进程,改善骨重塑,防治雌激素水平降低诱导的骨质疏松。研究目的:本研究构建Gpr81基因敲除小鼠模型和去卵巢手术(OVX)诱导骨量丢失小鼠模型,采用产生乳酸的HIIT(High-intensity Interval Training,HIIT)作为运动干预方案,通过体内组织和体外细胞实验,分析运动调控骨量丢失小鼠骨吸收进程的作用,并进一步揭示潜在的分子机制,为防治骨代谢相关疾病提供潜在的治疗靶点。研究方法:(1)实验分组:实验小鼠一共分为8组:WT+Sham(野生型+假手术)、WT+OVX(野生型+去卵巢手术)、WT+OVX+HIIT(野生型+去卵巢手术+高强度间歇运动)、WT+OVX+Lac(野生型+去卵巢手术+乳酸注射)、Gpr81-KO+Sham(基因敲除+假手术)、Gpr81-KO+OVX(基因敲除+去卵巢手术)、Gpr81-KO+OVX+HIIT(基因敲除+去卵巢手术+高强度间歇运动)、Gpr81-KO+OVX+Lac(基因敲除+去卵巢手术+乳酸注射);(2)Gpr81基因敲除小鼠模型:利用CRISPR/Cas9技术敲除Gpr81基因,获得Gpr81全敲小鼠模型(Gpr81-KO);(3)骨量丢失小鼠模型的构建:8周龄雌性小鼠进行双侧去卵巢手术,去卵巢第10周后检测小鼠骨密度降低了约50%,达到了降低20%的建模标准;(4)运动干预方式:每周5次,每次1小时的HIIT干预。每次运动干预10个循环,跑台速度为80%～90%最大速度的高强度运动,每次持续4分钟,中间进行2分钟速度为40%～50%最大速度的间歇运动;(5)外源性乳酸注射:根据运动干预的时间和频率,腹腔注射1g/kg的L-乳酸钠;(6)骨组织形态计量学指标:骨量、骨密度和骨小梁等指标,取小鼠新鲜股骨,用Micro-CT进行检测,取生长板下100帧用CTAnalysis软件进行分析;(7)破骨细胞分化功能实验:将骨髓源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMMs)以每孔1×10~4个接种于96孔板中,加入含有10%FBS的α-MEM培养基,同时分别加入终浓度10ng/ml和50ng/ml的M-CSF和RANKL将其诱导分化成破骨细胞,隔天换液,定向分化7天后,用TRAP染色分析破骨细胞分化功能;(8)蛋白提取和购买DS-3201WB:不同条件下处理后的破骨细胞使用PBS洗涤后注入RIPA溶解液,汇集细胞裂解液上清,并使用化学试剂盒进行蛋白质提取。在BCA法测定蛋白质浓度后,进行SDS-PAGE蛋白质电泳,之后经历转膜、封闭、洗膜、最后用ECL发光液使其在X-光胶片上曝光显示条带。研究结果:(1)与WT+Sham组相比,WT+OVX组小鼠体重显著增加(P<0.01);与WT+OVX小鼠相比,WT+OVX+Lac和WT+OVX+HIIT小鼠的体重均显著降低(P<0.01)。此外,WT+OVX+HIIT组和WT+OVX+Lac组小鼠的血乳酸水平显著高于WT+OVX小鼠(P<0.01)。(2)在野生型小鼠中,与WT+Sham组相比,WT+OVX组小鼠松质骨的BMD、BV/TV、TB.N和Tb.Th等指标显著降低(P<0.05)。与WT+OVX组相比,WT+OVX+HIIT组小鼠的松质骨的BMD、BV/TV和TB.N等指标显著升高(P<0.05)。此外,WT+Sham组、WT+OVX组、WT+OVX+Lac组和WT+OVX+HIIT组小鼠的皮质骨形态计量学指标无显著变化。(3)在基因敲除小鼠中,与Gpr81-KO+Sham组相比,Gpr81-KO+selleck合成OVX组小鼠的松质骨BMD、BV/TV和TB.N等指标显著降低(P<0.01)。与Gpr81-KO+OVX相比,Gpr81-KO+OVX+HIIT组小鼠松质骨BMD、BV/TV水平显著提升(P<0.05),但是WT+OVX+Lac组小鼠的松质骨BMD、BV/TV不存在显著的差异。此外,Gpr81-KO+Sham、Gpr81-KO+OVX、Gpr81-KO+OVX+HIIT、Gpr81-KO+OVX+Lac四组的皮质骨形态计量学指标无显著变化。(4)在体内实验中,相比WT+Sham组,WT+OVX组破骨细胞的活性显著增强,与WT+OVX组相比WT+OVX+HIIT组的破骨细胞活性显著减弱。在基因敲除小鼠骨组织切片的TRAP染色实验中,发现HIIT及乳酸注射均能够显著抑制OVX手术引起的破骨细胞活性增强。(5)在体外细胞实验中,与WT+Sham相比,来源WT+OVX组的BMMs定向诱导向破骨细胞分化的数目和面积均显著增多(P<0.01)。与WT+OVX组相比,来源WT+OVX+HIIT组的破骨细胞数量显著降低(p<0.01)。此外,来源WT小鼠的BMMs,在乳酸刺激后定向诱导向破骨细胞分化的数目显著减少(P<0.01),而来源KO组小鼠的BMMs,在乳酸刺激后定向诱导向破骨细胞分化的数目没有显著的变化。(6)分子机制层面:与WT+Sham相比,来源WT+OVX小鼠的破骨细胞中GPR81的表达无显著差异,但NF-k B(p-p65)蛋白表达显著升高(P<0.01),并且Tak1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。相比WT+OVX组,WT+OVX+HIIT组和WT+OVX+Lac组小鼠体外分化的破骨细胞中GPR81蛋白表达显著增加(P<0.01),NF-k B(p-p65)表达显著降低(P<0.01),而Tak1蛋白表达量显著增加(P<0.01)。与Gpr81-KO+OVX+medicinal and edible plantsHIIT组相比,Gpr81-KO+OVX+Lac组小鼠的NF-k B(p-p65)和Tak1蛋白表达无显著差异。研究结论:(1)OVX能够增加小鼠的体重,并引起骨量的丢失,HIIT能够提高小鼠体内血乳酸的水平,并抑制OVX引起的体重增加和骨量丢失。(2)8周HIIT干预和体外乳酸注射均能够通过抑制破骨细胞的分化,抑制骨吸收进程,提高小鼠的骨密度和骨量。(3)HIIT能够引起机体循环水平乳酸浓度的增加,通过激活破骨细胞膜上的乳酸受体GPR81,抑制胞内下游NF-k B(p-p65)信号通路,提高Tak1蛋白的表达,抑制了破骨细胞的分化。