目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,主要病理改变是黑质(substantia nigra,SN)纹状体通路中多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡。大量证据表明免疫炎症在PD发病中发挥重要作用,尸检结果显示PD患者黑质区含有大量反应性小胶质细胞。G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)是一种七次跨膜的雌激素膜受体,介导雌激素的快速非基因组效应。在中枢神经系统,GPER在神经元和胶质细胞中有广泛表达,其介导的信号途径具有抗炎、抗凋亡等神经保护作用。人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)是中药人参的主要药理活性成分,具有抗衰老、神经营养、辅助抗肿瘤等作用。在前期工作中,课题组应用离体培养的小胶质细胞,证明Rg1能够通过GPER对抗脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的炎症反应,但在整体动物水平中,人参皂苷Rg1是否能够对抗LPS诱导的小鼠黑质区炎症反应?其机制是否与GPER有关?目前尚不清楚。本研究拟应用3-4月龄和14-16月龄GPER野生型(GPER~(+/+))和GPER基因敲除(GPER~(-/-))C57BL/6J小鼠制备PD炎症模型,探讨GPER基因敲除对不同年龄小鼠黑质区炎症反应的影响,明确GPER是否参与人参皂苷Rg1的抗炎神经保护作用。方法:1.应用立体定位技术,分别在3-4月龄和14-16月龄GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠黑质区注射LPS,建立PD炎症模型,腹腔注射Rg1(10 mg/kg),连续给药14天。2.应用爬杆和转棒实验,检测小鼠的运动协调能力。3.应用荧光定量PCR(Quantitative PCR,q PCR)技术检测酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH),促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(intereukin-1β,IL-1β)、环氧化酶(cyclooxygenase-2,COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)以及焦亡相关因子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family,pyrin domaincontaining 3,NLRP3)的m RNA水平。4.应用蛋白免疫印迹实验(western blotting)检测多巴胺合成限速酶TH、促炎因子COX-2和i NOS以及焦亡相关因子NLRP3的蛋白水平。结果:1.在3-4月龄小鼠组,黑质区注射LPS能够诱导GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠转棒停留时间明显缩短、爬杆转头和下杆时间显著延长(P<0.01,P<0.001)。在GPER~(+/+)小鼠,Rg1能够改善LPS诱导的小鼠运动失调(P<0.05,P<0.001);但在GPER~(-/-)小鼠,Rg1的改善作用明显减弱(P<0.001)。2.在3-4月龄小鼠组,LPS能够显著降低GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠黑质和纹状体区TH的表达(P<0.001)。在GPER~(+/+)小鼠,Rg1能够显著抑制LPSCaptisol作用的损伤作用(P<0.01,P<0.001);但在GPER~(-/-)小鼠,Rg1的神经保护作用消失(P<0.01,P<0.001)。3.在3-4月龄小鼠组,LPS能够显著诱导GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠黑质区促炎因子TNF-α、IL-1β、COX-2、i NOS基因表达以及COX-2、i NOS蛋白表达上调(P<0.01,P<0.001)。Rg1能够明显抑制上述促炎因子的表达升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001);而GPER基因敲除后,Rg1的抗炎作用明显减弱(P<0.01,P<0.001)。此外,在GPER~(-/-)小鼠,LPS诱导的促炎因子TNF-α和IL-1β的基因表达较GPER~(+/+)小鼠显著升高(P<0.01,P<0.001),提示GPER基因敲除,增加了小鼠对LPS炎性刺激的敏感性。4.在3-4月龄小鼠组,LPS能够上调GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠黑质区焦亡相关因子NLRP3表达(P<0.01,P<0.001)。在GPEsmall- and medium-sized enterprisesR~(+/+)小鼠中,Rg1能够抑制此作用(P<0.05,P<0.01);而GPER基因敲除后,Rg1不能下调PD炎症小鼠黑质区NLRP3表达(P<0.001)。5.在14-16月龄小鼠组,LPS能够诱导GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠运动障碍,表现为转棒停留时间缩短(P<0.05,P<0.01)。Rg1能够延长野生型PD小鼠棒上停留时间(P<0.01);而GPER基因敲除后Rg1的上述作用显著减弱(P<0.05)。在爬杆实验中,LPS能诱导GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠PD小鼠转头(T-turn)时间延长(P<0.05),在GPER~(+/+)小鼠,Rg1对此能够发挥保护作用(P<0.05),但在GPER~(-/-)小鼠,Rg1的保护作用有减弱的趋势,但无统计学意义;在下杆时间(T-total)检测中,LPS处理后,GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠均没有表现出显著的时间延长。与3-4月龄小鼠对照组相比,14-16月龄小鼠运动协调能力有所下降,表现为转棒停留时间缩短,转头和下杆时间延长。6.在14-16月龄小鼠组,LPS可使GPER~(+/+)和GPER~(-/-)黑质区、纹状体的TH表达显著降低(P<0.01,P<0.001)。在GPER~(+/+)小鼠,Rg1能够显著改善LPS引起的TH表达降低(P<0.001);但在GPER~(-/-)小鼠,Rg1的神经保护作用消失(P<0.01,P<0.001)。对比3-4月龄和14-16月龄小鼠黑质区TH基因表达情况,结果显示LPS对14-16月龄组小鼠DA能神经元的损伤更为严重。7.在14-16月龄小鼠组Docetaxel NMR,LPS能够显著诱导GPER~(+/+)和GPER~(-/-)小鼠黑质区促炎因子TNF-α、IL-1β和COX-2 m RNA表达及COX-2、i NOS蛋白表达上调(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。在野生型小鼠中Rg1能够抑制上述促炎因子的升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),GPER基因敲除后Rg1的抗炎作用明显减弱(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。8.在14-16月龄小鼠组,Rg1能够抑制LPS诱导的野生型小鼠黑质区中NLRP3焦亡因子基因和蛋白的升高(P<0.05,P<0.01)。GPER基因敲除后,Rg1的此作用明显减弱(P<0.01)。结论:1.Rg1能够抑制LPS诱导的3-4月龄和14-16月龄PD小鼠炎症反应,GPER基因缺失显著抑制了Rg1的抗炎神经保护作用。2.GPER基因缺失可导致3-4月龄小鼠黑质区DA能神经元对LPS的敏感性增加。