金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类化脓感染中最常见的病原菌,可产生多种毒Membrane-aerated biofilter力因子Gefitinib浓度,既能引起局部皮肤或组织的化脓性感染,也可以引起内脏器官甚至危及全身的感染。持留菌(Persister)是细菌群体中一小部分对抗生素不敏感的细菌亚群,本质是细菌的一种休眠状态,在这种状态下可以逃避抗菌药物的杀伤以及宿主免疫应答。本实验室在前期的研究中得到了谷氨酸合酶大亚基基因(Glutamate synthase,large subunit gene,gltB)的敲除株,并且发现由于gltB的缺失会导致金黄色葡萄球菌持留菌和L-型、色素形成能力降低。目的:探究gltB影响金黄色葡萄球菌Newman株持留菌形成、细胞壁合成以及金黄色色素合成的分子机制,为金黄色葡萄球菌持留菌的防控提供新的药物靶点。方法:1.微量肉汤稀释法测定多种抗菌药物对金黄色葡萄球菌Newman株与ΔgltB株的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)。2.不同抗菌药物(氨苄青霉素、左氧氟沙星)暴露试验测定Newman株与ΔgltB株在培养的不同时间点的持留菌形成状况;Newman株、ΔgltB株、外源补充谷氨酸的ΔgltB株的持留菌形成状况。3.测定WT::pRAB11、ΔgltB::pRAB11、ΔgltB::pRABgltB在脱水四环素诱导下的生长曲线以及对热、酸、氧化剂以及饥饿的抵抗能力;不同抗菌药物(氨苄青霉素、诺氟沙星、庆大霉素、万古霉素)暴露试验测定三菌株的持留菌形成状况。4.收集Newman株与ΔgltB株培养至48h的菌体沉淀进行转录组学测序(RNA-seq)及生物信息学分析。Q-PCR验证结果。5.观察Newman株、ΔgltB株、外源补充组氨酸的ΔgltB株在抗菌药物(氨苄青霉素、左氧氟沙星)的作用下持留菌形成情况。Q-PCR测定在不同时间点下Newman株与ΔgltB株中相关基因的表达水平。6.将Newman株、ΔgltB株以及外源补充谷氨酸、组氨酸的ΔgltB株培养至18h的菌液接种至L-型诱导培养基,观察四种菌液的L-型形成能力。7.通过透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察金黄色葡萄球菌Newman株与ΔgltB株的菌细胞超微结构;选用原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)检测两种菌株的生物力学特性。Q-PCR测定Newman株与ΔgltB株中相关基因的表达水平。8.收集培养6h和48h在脱水四环素诱导下的WT::pRAB11、ΔgltB::pRAB11、ΔgltB::pRABgltB三种菌株沉淀,比较色素形成的差异,测定金黄色色素含量;Q-PCR测定相关基因在三种菌株中的表达水平。结果:1.相较于Newman株,ΔgltB株对多种抗菌药物的MIC和MBC更低,ΔgltB株对抗菌药物更加敏感。2.Newman株与ΔgltB株的48h培养物比较,在氨苄青霉素和左氧氟沙星作用下,ΔgltB株持留形成能力明显降低,表现为药物作用下分别在8d和6d无活菌存在,而Newman株仍有活菌存在。外源补充谷氨酸之后,ΔgltB株对氨苄青霉素和左氧氟沙星的耐受力明显增强,表现为在氨苄青霉素的作用下,ΔgltB株在9d左右已无活菌存在,而补充谷氨酸的ΔgltB株仍有10~6CFU/m L左右活菌数存在;在左氧氟沙星的作用下,ΔgltB株在7d左右已无活菌存在,补充谷氨酸的ΔgltB株与Newman株在10d左右全部死亡。3.在脱水四环素诱导下的WT::pRAB11、ΔgltB::pRAB11、ΔgltB::pRABgltB在16h前的生长速度慢于无诱导剂培养的WT::pRAB11。WT::pRAB11对热、酸、氧化剂以及饥饿抵抗力强于ΔgltB::pRAB11;回补gltB后ΔgltB株部分恢复了对上述压力的抵抗。在培养至3h时,WT::pRAB11、ΔgltB::pRAB11、ΔgltB::pRABgltB对(氨苄青霉素、诺氟沙星、庆大霉素、万古霉素)均敏感;培养至24h、48h和72h时,WT::pRAB11对四种抗菌药物的耐受性均显著强于ΔgltB::pRAB11,回补gltB后,ΔgltB::pRABgltB对四种抗菌药物的耐受性恢复。4.RNA-seq结果显示,ΔgltB株相较于Newman株共筛选出184个差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs),其中上调8个,下调176个。DEGs主要分布于组氨酸代谢、微生物代谢、群体感应、ABC转运系统、次级代谢产物的生物合成和双组分系统。5.外源补充组氨酸之后,ΔgltB株在氨苄青霉素和左氧氟沙星作用下形成持留菌能力明显增强,表现为在致死浓度的氨苄青霉素作用下,ΔgltB株在9d左右全部被杀死,而补充组氨酸的ΔgltB株仍有10~5CFU/m L左右活菌存在;在致死浓度的左氧氟沙星作用下,ΔgltB株在7d左右全部被杀死,补充组氨酸的ΔgltB株仍有10~3CFU/m L左右活菌存在。Q-PCR实验表明,Newman株与ΔgltB株的组氨酸合成相关基因his F、his H、his C、his D的表达水平在不同时间点有显著差异,其中在培养24h、48h和72h时,相关基因在ΔgltB株中的表达水平显著低于Newman株(P<0.05)。6.Newman株、外源补充谷氨酸/组氨酸的ΔgltB株在LIM培养基上经过72h培养,均能观察到形态典型的“油煎蛋”样菌落,而ΔgltB株形成的“油煎蛋”样菌落数量较少。7.在TEM下观察到的ΔgltB株的细胞壁明显薄于Newman株(76.07±8.16nm vs 38.70±6.60 nm)(P<0.05);在原子力显微镜下,ΔgltB株的表面较Newman株更为粗糙且不完整,ΔgltB株的杨氏模量(8.60±2.20 k Pa)显著低于Newman株的杨氏模量(14.12±3.35 k Pa),ΔgltB株的细胞壁相较于Newman株的细胞壁更软。细胞壁合成相关基因NWMN＿1063、mru D、mra Y、fem B在ΔgltB株的表达水平明显低于Newman株(P<0.05)。8.ΔgltB::pRAB11产生的金黄色色素在培养24h后明显少于WT::pRAB11,在回补gltB之后,金黄色色素合成能力有所恢复(P<0.05);金黄色色素合成相关基因(mvas、crt Q、crt M)在ΔgltB::pRAB11的表达水平显著低于WT::pRAB11,在回补gltB之后,相关基因的表达水平恢复(P<确认细节0.05)。结论:1.gltB影响金黄色葡萄球菌稳定期后期及之后持留菌和L-型的形成与谷氨酸、组氨酸的合成密切相关。2.gltB的缺失可以影响金黄色葡萄球菌细胞壁的合成,其作用机制与gltB敲除导致L-谷氨酸产量减少,进而引发NWMN＿1063的表达水平降低有关。3.gltB的缺失导致金黄色色素合成途径中的相关基因表达降低,从而影响金黄色葡萄球菌金黄色色素的合成。