棉花是我国重要的经济作物之一,培育高产优质棉花品种,对提高我国棉花产品竞争力,促进我国棉花产业可持续健康发展有着重要意义。研究揭示棉纤维发育的遗传机制,可为棉花纤维品质改良提供重要的理论依据。作为植物大型转录因子家族之一,MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)类转录因子广泛参与棉纤维起始、伸长以及次生壁的增厚等过程中。本实验室在先前研究中鉴定了一个在棉纤维伸长发育中发挥正调控作用的MYB转录因子—GhMYBL2(MYB-like2),该蛋白存在多个潜在的MAPK(mitogen-activated protein kinase)磷酸化位点,暗示着该蛋白的功能可能受到MAPK级联磷酸化调控。基于此,本文对MAPK介导的GhMYBL2磷酸化参与棉花纤维发育的分子机制进行了深入研究。主要获得的研究结果如下:1.GhMYBL2互作MAPK蛋白的筛选鉴定通过基因表达模式分析,本研究发现Gh MAPK3/5/6/6a/13/16/23/26的表达模式与GhMYBL2相似,均存在共表达现象。体内LCI(萤火虫荧光素酶片段互补图像技术)验证Gh MAPK3/5/6/6a/23与GhMYBL2之间均存在相互作用,且GhMAPK6a与GhMYBL2相互作用最强;体外Pull-down实验也验证了GhMAPK6a与GhMYBL2的互作。2.GhMAPK6a磷酸化GhMYBL2第63位和第158位的丝氨酸为了检测GhMAPK6a获悉更多对GImmune functionhMYBL2的磷酸化作用,本研究采用体外磷酸化实验及Zn~(2+)-Phos-tag SDS-PAGE实验证实了GhMAPK6a能够在体外磷酸化GhMYBL2蛋白。序列分析结果显示,该蛋白第63位及158位的潜在MAPK激酶磷酸化位点在各物种的同源蛋白中是保守的,意味着这两个位点可能是GhMAPK6a的磷酸化位点。进一步利用点突变技术及原核表达系统,本研究分别获取了第63位丝氨酸突变成丙氨酸的GhMYBL2~(S63A)、第158位丝氨酸突变成丙氨酸的GhMYBL2~(S158A)和第63位及第158位丝氨酸都突变为丙氨酸的GhMYBL2~(S63AS158A)3种磷酸化位点突变蛋白。随后对其进行了体外磷酸化及Zn~(2+)-Phos-tag SDS-PAGE实验,结果显示这两个位点突变后,GhMYBL2的磷酸化程度明显降低,说明GhMAPK6a磷酸化GhMYBL2的磷酸化位点主要是63位和158位。3.GhMYBL2磷酸化能够增强其蛋白稳定性本研究分别从亚细胞定位、蛋白稳定性selleck激酶抑制剂、与靶DNA结合的能力及与互作蛋白的结合能力四个方面探究了GhMYBL2的磷酸化调控其功能的分子机制。亚细胞定位分析表明GhMYBL2、GhMYBL2~(S63A)、GhMYBL2~(S158A)和GhMYBL2~(S63AS158A)4种蛋白均定位于细胞核,说明GhMYBL2的磷酸化不影响其核定位。Cell-free体外降解实验表明,GhMYBL2通过泛素介导的26s/蛋白酶体途径进行降解,且当其磷酸化位点突变后降解速度加快,说明了GhMYBL2第63位及158位Ser的磷酸化会增强其蛋白的稳定性。磷酸化位点突变型蛋白与靶DNA基序进行EMSA(凝胶迁移或电泳迁移率实验)显示,它们均能与靶标DNA结合,且结合程度没有明显变化,说明GhMYBL2的磷酸化不会影响蛋白与DNA的结合能力。此外,酵母双杂交实验结果表明,磷酸化位点突变与否不影响GhMYBL2蛋白与其互作蛋白Gh TPL3/4的结合。4.GhMAPK6a参与棉纤维伸长发育为了探究GhMAPK6a是否参与棉纤维伸长发育,本研究利用VIGS(病毒诱导的基因沉默技术)在棉花中抑制GhMAPK6a的表达,纤维长度测量统计分析发现,与对照相比,TRV2:GhMAPK6a植株的成熟棉纤维的长度明显变短,说明GhMAPK6a正调控棉纤维伸长发育。为了对GhMAPK6a的功能进行进一步的研究,本研究利用CRISPR-Cas9技术创建GhMAPK6a功能丧失型棉花突变体植株,目前已经得到部分转基因植株。初步观察发现这些棉花植株较矮小,且在一定程度上失去了顶端优势,但其棉纤维发育是否受到影响仍有待后续研究。