研究背景近年来,慢性肾脏病对人们健康的影响愈发严重,严重影响人们日常生活,引发全球广泛关注,氟氯氰菊酯作为环境内分泌干扰物,能够影响肾脏系统,但有关氟氯氰菊酯暴露造成肾脏功能损伤的研究较少。大量研究表明,氧化应激、炎症反应在肾脏损伤过程中有着重要作用。研究表明,在肾脏损伤过程中,肾脏组织氧化应激水平增高,炎症相关因子表达升高,MAPK信号通路被激活,同时GADDD45B基因与肾脏损伤过程密切相关。本研究通过建立氟氯氰菊酯致大鼠损伤模型,探究GADD45B基因介导的p38MAPK/JNK通路在氟氯氰菊酯致大鼠肾脏组织及肾小管上皮细胞损伤过程中的作用机制,为后续氟氯氰菊酯致肾脏损伤的研究提供理论依据。研究目的本研究通过建立氟氯氰菊酯诱导大鼠肾小管损伤的体内模型,探究GADD45B基因和JNK/p38MAPKMirdametinib抑制剂信号通路在氟氯氰菊酯致肾脏功能损伤中的作用机制,为后续阐明毒理机制并寻找氟氯氰菊酯致肾脏损伤的早期生物标志物,为防治环境内分泌干扰物引起的肾脏病变提供理论依据。研究方法1.建立氟氯氰菊酯致大鼠肾小管损伤体内模型选取SPF级Wistar雄性大鼠40只,随机分为4组,每组10只,分别为空白对照组、低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组,隔天灌胃染毒,每周称量大鼠体质量,连续28天,麻醉处死,取大鼠肾脏组织。2.观察氟氯氰菊酯对大鼠肾脏损伤变化对大鼠进行每日体重监测,观察大鼠体重变化情况,同时注意氟氯氰菊酯是否影响大鼠肾脏脏器系数;HE染色观察氟氯氰菊酯致大鼠肾脏组织形态结构变化;透射电镜观察氟氯氰菊酯致大鼠肾脏细胞超微结构的病理损伤变化;LDH试剂盒检测氟氯氰菊酯染毒后大鼠肾脏组织LDH的含量变化。3.检测氟氯氰菊酯对大鼠肾脏氧化应激损伤和肾功能指标变化通过氧化应激试剂盒检测氟氯氰菊酯染毒后大鼠肾脏MDA和SOD的变Knee biomechanics化情况;通过Elisa试剂盒检测氟氯氰菊酯染毒后大鼠血清中血尿素氮和血清肌酐含量的变化。4.检测氟氯氰菊酯对大鼠肾脏炎症水平以及GADD45B表达变化通过Western blot、q-PCR检测炎症因子IL-6和TNF-α表达水平的变化;通过Western blot、q-PCR以及免疫组化检测氟氯氰菊酯染毒后对大鼠GADD45B基因表达水平的变化。5.检测氟氯氰菊酯染毒对大鼠肾脏损伤中MAPK通路关键因子的表达变化通过Western blot、q-PCR对MAPK通路关键因子及磷酸化指selleck PR-171标的m RNA及蛋白相对表达水平进行检测,并通过免疫荧光双标染色法检测GADD45B基因与MAPK通路关键因子共表达情况。研究结果1.氟氯氰菊酯致大鼠肾脏损伤情况HE染色结果显示,对照组中肾小管和肾小球形态结构无异常;低剂量组肾小球开始出现轻度萎缩,肾小管管腔出现水肿扩张;中剂量组肾小球明显萎缩,肾小管管腔明显扩张;高剂量组肾小球重度萎缩,肾小管扩张更加严重,肾间质可见炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞大量脱落。透射电镜结果显示,对照组中肾小管上皮细胞排列规则,线粒体和细胞核结构均正常,低剂量组基底膜有所增厚,足突轻度肿胀,线粒体出现肿胀;中剂量组基底膜明显增厚,足突发生融合,线粒体明显肿胀;高剂量组基底膜重度增厚,界限不清,足突大片融合,线粒体严重肿胀,出现致密沉积物。LDH检测结果显示,与对照组相比,低、中、高剂量组LDH含量明显升高,且呈剂量依赖性(P<0.05)。染毒4周后,各染毒组大鼠的体质量变化无统计学意义(P>0.05);各染毒组大鼠肾脏组织重量和脏器系数变化无统计学意义(P>0.05)。说明氟氯氰菊酯能够诱导大鼠肾脏组织损伤。2.氟氯氰菊酯致大鼠肾脏氧化应激损伤和肾功能指标变化情况肾功能指标检测结果显示,与对照组相比,中、高剂量组BUN、Cr明显升高(P<0.05)。氧化应激指标检测结果显示,与对照组相比,低、中、高剂量组SOD活力明显下降,中、高剂量组MDA含量明显上升(P<0.05)。说明氟氯氰菊酯能够诱导大鼠肾脏组织发生氧化损伤和肾功能障碍。3.氟氯氰菊酯致大鼠肾脏炎症水平以及GADD45B表达变化情况炎症因子检测结果显示,IL-6和TNF-α的表达随着染毒剂量的增加而增加,说明机体发生炎症反应。Western blot和q-PCR结果显示,GADD45B的相对蛋白及m RNA表达水平随着染毒剂量的增加而增加;免疫组化结果显示,GADD45B阳性表达呈棕黄色,主要位于肾脏的肾小管上皮细胞中,与对照组相比表达水平逐渐升高,高剂量组最为显著。4.MAPK通路参与氟氯氰菊酯对肾脏的损伤Western blot和q-PCR结果显示,与对照组相比,随着染毒剂量的增加,肾脏组织中p-JNK、p-p38MAPK、ERK的蛋白和m RNA表达水平明显升高(P<0.05),JNK、p38MAPK、p-ERK的蛋白和m RNA表达水平明显降低(P<0.05)。免疫荧光双标染色结果显示,GADD45B与J NK共表达于肾小管中,低、中、高染毒组中GADD45B与JNK荧光信号较对照组逐渐增强;p38MAPK主要表达与肾小球的毛细血管内皮细胞中,低、中、高染毒组中GADD45B与p38MAPK荧光信号较对照组逐渐增强。结论1.氟氯氰菊酯具有一定的肾脏毒性,可引起大鼠肾脏形态结构损伤,伴有明显氧化损伤、炎症的发生以及肾功能障碍。2.氟氯氰菊酯可引起GADD45B表达升高,进而激活p38MAPK/JNK通路诱导大鼠肾脏损伤的发生。