目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)被认为是最具危险性的癌症类型之一,其死亡率高,早期容易出现转移。HCC的根治性治疗方法包括肝切除和原位肝移植,然而,大多数HCC患者伴有肝硬Severe malaria infection化,肝切除的可能性低。目前大多数HCC患者主要使用索拉非尼治疗,但总体生存率低,预后也差。平衡型核苷转运蛋白3(EquiliDecitabine试剂brative Nucleoside Transporter3,ENT3)是定JNJ-42756493采购位于溶酶体和线粒体的胞内核苷和核碱基转运蛋白,对胞内的核苷、核碱基转运至关重要。研究ENT3通过调控AKT/mTOR信号通路促进HCC细胞增殖、转移和侵袭的作用机制,探寻HCC的预后标记分子,为开展可能的靶向治疗奠定理论基础。方法:利用GEPIA、UALCAN和TIMER数据库,分析ENT3在泛癌中的差异表达,及与临床病理参数和疾病预后的相关性。通过sh RNA技术构建敲减ENT3表达的大肠杆菌,利用平板划线分离提纯,再进行增菌培养,提取细菌内质粒DNA。通过细胞体外转染技术将敲减ENT3表达的质粒DNA转染至肝癌细胞株,利用蛋白免疫印迹验证敲减效率。采用体外细胞生物学功能实验,如细胞增殖、细胞克隆、伤口愈合、Transwell迁移和侵袭实验验证敲减ENT3对HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞仪检测敲减ENT3后细胞周期和细胞凋亡状态。通过R软件分析TCGA数据库肝癌基因表达组数据,对ENT3基因集合富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)。使用STRING数据库探索ENT3编码蛋白与ENT3通过调控AKT/mTOR信号通路促进肝细胞癌进展的机制研究2023届硕士学位论文富集通路关键蛋白互作关系。通过Linked Omics数据库,分析ENT3在HCC中的转录组数据,探索ENT3相关性基因的基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集情况。采用蛋白免疫印迹检测敲减ENT3与AKT/mTOR信号通路的相关性。使用AKT激动剂SC79激活AKT/mTOR信号通路,观察SC79是否能够恢复敲减ENT3对AKT/mTOR信号通路的抑制作用。结果:ENT3在嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(Pheochromocytoma and Paraganglioma,PCPG)、直肠腺癌(Rectum Adenocarcinoma,READ)、肝细胞癌(Liver Hepatocellular Carcinoma,LIHC)等多种恶性肿瘤中的表达上调。ENT3在HCC中的异常激活与患者的不良预后、临床病理学指标密切相关。在体外细胞模型中,敲减ENT3可以抑制HCC细胞活力、细胞增殖、细胞迁移和侵袭,诱导细胞周期S期阻滞,促进细胞凋亡。GO/KEGG结果显示,ENT3相关性基因与细胞感染、核苷酸代谢、DNA结合和转录调节等相关。GSEA通路富集分析提示,ENT3相关性基因可以激活AKT/mTOR信号通路、明星致癌基因MYC、DNA修复过程等。敲减ENT3可以降低p-AKT和p-mTOR蛋白的表达,抑制AKT/mTOR信号通路的下游效应因子p-p70S6K1蛋白的表达、促进p-4EBP1蛋白的表达。SC79可以部分恢复敲减ENT3对p-AKT、p-mTOR和p-p70S6K1蛋白表达水平的抑制作用,降低敲减ENT3对p-4EBP1蛋白表达水平的促进作用。结论:ENT3在HCC中高表达,且与患者预后不良有关。ENT3通过调控AKT/mTOR信号通路促进HCC细胞的增殖、转移和侵袭。