背景:胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是消化系统常见的恶性肿瘤,其发病率呈快速上升趋势。根据全球最新癌症统计数据显示,胰腺癌已经成为肿瘤致死的第七大原因,并且发病率以每年0.5%-1.0%的比例快速增长,据估计,胰腺癌将在2030年成为第二大肿瘤相关致死原因。早期高转移是胰腺导管腺癌最显著的特点。超过50%的胰腺导管腺癌患者,初诊时已经发生远处转移,即便经历完全手术切除的患者,绝大部分患者术后4年内发生即可发生复发转移,提示胰腺导管腺癌早期即可形成远处的微转移灶。目前,尽管已经明确多个与胰腺导管腺癌转移相关的信号通路改变与基因突变,但是介导胰腺癌转移的核心分子机制仍不清楚。因此,研究胰腺癌转移的深在机制对于揭示胰腺癌早期高转移的特征和研发新兴治疗靶点有重要作用。除了经典的KRAS、CDKDA2、TP53、SMAD4基因突变以外,上述关键基因介导的转录因子的异常激活和转录因子自身异常表达也在胰腺导管腺癌的发生、侵袭转移、血管形成和药物抵抗中发挥着重要的作用。转录因子ETV4(ETS translocation varMRTX1133 IC50iant 4)属于PEA3亚家族,是ETS转录因子超家族的重要一员。正常生理状态下,ETV4,联合家族其他成员ETV1和ETV5,参与调控胚胎正常发育、激素代谢以及细胞运动协调。而最新的研究发现,ETV4在多种肿瘤组织中高表达,并且可以调控肿瘤细胞的运动和定向迁移进而促进多种肿瘤的侵袭和转移。在胰腺导管腺癌中,有研究提示ETV4在腺癌组织中高表达,但是,到目前为止,ETV4与胰腺导管腺癌转移的关系仍不清楚,其潜在的分子机制有待进一步探索。目的:探究ETV4在胰腺导管腺癌中表达情况以及促进肿瘤转移的具体分子机制,为临床干预胰腺导管腺癌的转移提供理论价值和潜porous medium在治疗靶点。1.明确ETV4在胰腺导管腺癌组织中的表达情况以及与肿瘤远处转移和患者预后的关系;2.明确ETV4与胰腺导管腺癌侵袭转移的关系;3.揭示ETV4在胰腺导管腺癌细胞系中下游分子作用靶点;4.探索CXCL13促进ETV4表达及胰腺导管腺癌侵袭转移的机制;5.探索靶向CXCL13/ETV4/CXCR5正反馈信号轴抑制肿瘤转移的潜在策略;6.在胰腺导管腺癌临床样本中,验证ETV4和CXCL13、CXCR5之间的相关性。方法:1.利用免疫组化在胰腺导管腺癌组织芯片中检测ETV4在癌组织与癌旁组织中的表达情况,并分析其与患者临床病理参数之间的相关性;通过TIACS-10759分子量CGA数据库,进一步分析在胰腺导管腺癌组织与癌旁组织中,ETV1、ETV4和ETV5的m RNA水平表达的差异情况;最后,利用Cox比例风险模型评估ETV4的表达与患者预后的关系。2.通过慢病毒感染细胞,构建ETV4稳定敲减或者过表达的胰腺导管腺癌细胞系。采用Transwell实验、Invasion实验、细胞划痕实验和裸鼠肺转移瘤模型,评估ETV4对肿瘤细胞体内外侵袭转移的影响;免疫荧光、Western Blot和免疫组化染色检测ETV4过表达或者下调后,上皮间质转化关键分子的变化情况;采用细胞增殖实验,诱导凋亡实验以及裸鼠皮下成瘤实验,评估ETV4表达对肿瘤细胞增殖的影响。3.利用全基因转录组测序(Whole-gene transcriptome sequencing)筛选ETV4下游直接作用靶基因。并利用Western blot、q RT-PCR、免疫荧光染色、染色质免疫共沉淀以及双荧光素酶报告基因等实验,明确ETV4对下游靶分子的转录调节作用;并利用Transwell实验、Invasion实验和裸鼠肺转移模型明确下游靶基因对于ETV4介导的肿瘤转移的必要性。4.使用外源性CXCL13重组人源化蛋白处理PANC-1和CAPAN-2细胞,Western blot检测ETV4、CXCR5和信号通路下游分子蛋白水平的变化;采用信号通路特异性抑制剂处理细胞,Transwell和Invasion实验检测细胞迁移、侵袭能力变化等途径,探究CXCL13促进ETV4表达及胰腺导管腺癌转移的机制。5.利用慢病毒感染PANC-1细胞系,在CXCL13过表达的基础上同时沉默ETV4,利用Transwell细胞迁移和侵袭实验以及裸鼠肺转移瘤实验,明确ETV4对于CXCL13/CXCR5介导肿瘤转移的必要性。6.利用CXCR5中和抗体处理细胞系,检测ETV4,CXCR5和p-ERK1/2蛋白水平的变化,结合细胞迁移和侵袭能力的变化,探究CXCR5中和抗体对CXCL13/CXCR5/ETV4正反馈轴促进胰腺导管腺癌转移的阻断作用。结果:1.ETV4在PDAC组织中的表达水平显著高于癌旁组织,并且ETV4表达水平与患者的不良预后呈现正相关,单因素和多因素的Cox回归分析发现,ETV4高表达是患者预后的独立危险因素。2.过表达ETV4促进胰腺导管腺癌细胞的增殖和侵袭转移,相应地,下调ETV4则起到相反的作用;此外,ETV4能够显著促进肿瘤细胞的上皮间质转化。3.根据RNA-seq以及双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀实验结果,ETV4能够直接转录激活CXCR5的表达,位点突变实验进一步证实,ETV4直接结合到CXCR5启动子区-894至-885位置;细胞迁移和侵袭实验证实了CXCR5对于ETV4介导肿瘤细胞转移的必要性。4.外源性CXCL13重组人源化蛋白通过结合其特异性配体CXCR5,激活ERK1/2信号,促进ETV4的表达PDAC细胞的迁移侵袭;ERK1/2抑制剂或者沉默CXCR5均可以阻断信号通路转导进而抑制ETV4的表达和肿瘤细胞的迁移和侵袭。5.体内、体外细胞侵袭转移实验均证实,ETV4对于CXCL13/CXCR5信号介导的胰腺导管腺癌转移的必要性。6.CXCR5中和抗体能够抑制CXCL13/CXCR5/ERK信号传导,进而抑制ETV4和p-ERK1/2的表达和肿瘤细胞的迁移侵袭;此外,在ETV4过表达的PANC-1细胞中,给予CXCR5中和抗体处理,发现中和抗体能够部分降低p-ERK1/2水平以及ETV4介导的细胞迁移侵袭;最后,在20例新鲜冰冻胰腺导管腺癌组织中发现,ETV4与CXCL13和CXCR5的m RNA水平显著呈正相关。结论:本研究明确了ETV4在胰腺导管腺癌组织和高转移性细胞系中高表达并且与患者的不良预后呈现正相关;机制上,首次发现ETV4可以通过直接转录激活CXCR5,促进胰腺导管腺癌的上皮间质转化和侵袭转移;同时,趋化因子CXCL13通过结合其特异性配体CXCR5,激活ERK1/2信号,促进ETV4的表达和胰腺导管腺癌细胞系的迁移侵袭,使用ERK1/2抑制剂、CXCR5中和抗体或者下调ETV4的表达均可以抑制CXCL13/CXCR5介导的胰腺导管腺癌转移,最终形成了以CXCL13/ETV4/CXCR5为核心轴的反馈调节机制促进了胰腺导管腺癌的转移。本研究为胰腺导管腺癌转移的发生机制提供了新的认识,同时也为转移性胰腺导管腺癌的治疗提供了新的思路和潜在的靶点。