研究背景:结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercuJosis,Mtb)引起的结核病(Tuberculosis,TB)是世界上存在最久的传染病之一。宿主的天然免疫和适应性免疫共同参与抗结核感染的过程。其中,巨噬细胞是天然免疫的重要组成部分,在Mtb感染中发挥的作用不可忽视。胞嘧啶单磷酸激酶2(CMPK2)是一种参与线粒体基因组复制的单磷酸激酶,通过影响线粒体DNA的复制来调控炎症小体的激活;同时CMPK2参与线粒体稳态的维持,线粒体稳态失调将导致神经退行性疾病。另外,CMPK2作为一种干扰素刺激基因(Interferon-Stimulated Genes,ISG),在人类免疫缺陷病毒和登革病毒的感染免疫中发挥重要作用,但目前仍欠缺CMPK2调节抗Mtb感染效应与机制Fulvestrant体外研究。研究方法:1.实时荧光定量 PCR 法(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和 Western blot检测Mtb感染后巨噬细胞中CMPK2的表达;2.菌落计数实验(Colony-Forming Units,CFU)检测CMPK2对巨噬细胞胞内荷菌量的影响;3.qRT-PCR检测CMPK2对感染Mtb巨噬细胞中线粒体DNA的复制和转录、促炎性细胞因子、糖酵解关键酶、IFN-β和ISG的mRNA水平等;4.酶联免疫吸附测定(ECore-needle biopsynzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测CMPK2对感染Mtb巨噬细胞的促炎性细胞因子分泌的影响;5.流式细胞术检测CMPK2对Mtb感染巨噬细胞的线粒体活性氧的影响;6.Western blot检测CMPK2对感染Mtb巨噬细胞凋亡和自噬的影响;7.试剂盒法检测CMPK2对感染Mtb巨噬细胞产生ATP和分泌乳酸的影响;8.核质分离结合免疫荧光法检测CMPK2在巨噬细胞中的定位;9.转录组测序分析沉默CMPK2对感染Mtb巨噬细胞中基因转录的影响;10.Western blot检测沉默CMPK2后巨噬细胞中早期内体标志蛋白VAMP3的表达,免疫荧光法检测VAMP3与Mtb的共定位;11.Western blot检测沉默CMPK2后巨噬细胞中溶酶体标志蛋白LAMP-1表达,免疫荧光法检测LAMP-1与Mtb的共定位;12.qRT-PCR和Western blot检测沉默CMPK2后巨噬细胞中TFEB的表达。研究结果:1.selleckchem PF-03084014Mtb感染的巨噬细胞中CMPK2的表达显著上调;2.CMPK2抑制结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活;3.CMPK2不依赖于其酶功能限制巨噬细胞内Mtb存活;4.CMPK2不参与调控巨噬细胞感染Mtb后的凋亡和自噬;5.CMPK2定位于巨噬细胞的细胞质和线粒体;6.CMPK2促进VAMP3的表达并增加早期内体与Mtb的共定位;7.CMPK2促进LAMP-1的表达并增加溶酶体与Mtb的共定位。结论:本课题研究发现,在Mtb感染巨噬细胞后,CMPK2表达上调,通过上调.早期内体的标志蛋白VAMP3和溶酶体标志蛋白LAMP-1的表达,促进了含菌吞噬体与溶酶体融合,从而达到加强溶酶体清除Mtb能力的目的。