纤毛是一种基于微管组装的、突出于细胞表面的毛发状细胞器,其结构和功能缺陷会导致多种人类遗传疾病。纤毛的发生是一个动态的过程,与细胞周期紧密相关。当细胞退出细胞分裂期进入静止期时,母中心粒转变成纤毛基体,起始纤毛的形成。纤毛由中心体转变而来,中心体相关蛋白发生突变往往会导致纤毛相关疾病的发生。Cep78(Centrosomal Protein of 78 k Da)是哺乳动物中分子量约为78 k Da的中心体蛋白,其突变会导致纤毛相关疾病。但目前我们对Cep78调控纤毛形成selleck HPLC的机制仍了解甚少,因此,对Cep78分子功能的研究能够为纤毛病的诊断和治疗提供参考,具有重要意义。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是细胞生物学和遗传学研究常用的经典模式生物,果蝇CG7886基因是哺乳动物Cep78的同源基因,关于CG7886的功能尚未有文献报道。本研究以黑腹果蝇为对象,分析Cep78在纤毛形成和精子发生方面的作用,以期揭示Cep78的分子功能。本研究主要分为三部分:第一部分:Cep78转基因果蝇的构建及亚细胞定位分析运用att P-Phi C31定点插入技术构建Cep78转基因果蝇品系。首先,构建含有att B位点和Cep78序列的重组质粒p JFRC2-Cep78-GFP,注射到带有att P位点的果蝇胚胎中,在Phi C31整合酶的作用下,Cep78-GFP序列被整合到果蝇的二号染色体上,最终获得红眼的Cep78转基因果蝇品系。其次,通过解剖Cep78转基因果蝇,对其触角和精巢进行免疫染色,利用激光共聚焦显微镜观察Cep7mycobacteria pathology8的亚细胞定位情况。结果显示,在感觉神经元纤毛中,Cep78定位在纤毛基部;在精巢中,Cep78定位在中心粒远端、纤毛过渡区和精子鞭毛上。第二部分:cep78敲除突变体果蝇的构建及表型分析运用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建cep78敲除突变体果蝇品系。首先,构建了一对带有打靶序列的重组质粒p EASY-BBMS-907351lunt-g RNA,注射到Cas9背景的果蝇中,通过果蝇杂交和基因型鉴定,获得了大片段缺失突变体果蝇品系。基因测序和峰图比对显示,该突变体第277位上的碱基缺失导致Cep78产生移码突变,但其杂合突变体果蝇雄性不育,难以获得纯合突变体。为了避免可能的显性负性效应(dominant negative effect)的影响,用同样的方法构建了完全敲除型突变体,该突变体只保留了3个氨基酸。其次,对cep78敲除突变体表型进行分析,发现敲除型果蝇生殖能力完全丧失,爬行能力也有所降低,推测Cep78敲除导致纤毛结构被破坏,不能产生成熟的精子。因此,用透射电镜(TEM)对敲除型果蝇纤毛/鞭毛的超显微结构进行分析,结果显示,果蝇精子轴丝结构被破坏,线粒体衍生物形成异常,精子不能正常地单个化,导致雄性敲除型果蝇不育,但其感觉神经元纤毛结构并没有发现明显异常。因此,Cep78在果蝇精子发生中具有重要作用。第三部分:Cep78调控基体延伸及机制分析cep78敲除突变体的一个重要表型是精母细胞中心粒明显变短,表明其在基体延伸和成熟中发挥重要作用。鉴于果蝇unc(Uncoordinated)突变体和cep120(Centrosomal Protein of 120 k Da)突变体具有类似的表型,我们通过果蝇杂交和免疫荧光研究三者之间的关系,结果显示:1)当Unc被敲除后,Cep120的定位显著减弱且Cep78完全消失;2)当Cep120或Cep78被敲除后,Unc的定位不受影响;3)当Cep120被敲除后,Cep78的定位显著减弱,且在Cep78被敲除后Cep120的定位也显著减弱,说明Cep120和Cep78位于Unc下游共同调控基体延伸。为了验证Cep78与Unc和Cep120之间是否具有相互作用,进行了GST pull-down和免疫共沉淀实验,结果显示Cep78与Unc和Cep120之间可直接相互作用。本研究以黑腹果蝇为对象,明确了Cep78在纤毛中的定位情况,分析了cep78敲除突变体中纤毛/鞭毛超显微结构的变化,揭示了Cep78在精子形成过程中基体延伸方面的功能和具体机制,为进一步研究中心粒长度的严格控制机制提供了实验依据,为全面地揭示纤毛形成和精子发生机制奠定了基础,同时也为纤毛病的研究和治疗提供了借鉴。