【目的】两栖动物生活于组成因素复杂的恶劣环境中,它们裸露的皮肤缺乏足够的结构性屏障,为了在严苛的环境中生存,两栖类生物进化出了独特又重要的防御体系,承担着诸如呼吸、维持水电解质平衡及防御等生理功能。两栖类动物皮肤通过对外分泌生物活性物质,来保证自身正常生理功能的发挥,其中包含各种功能各异的生物活性肽,对这些活性多肽进行深入研究能使我们:第一,进一步认识两栖动物适应环境生存和进化的可能分子机制;第二,两栖动物来源的活性多肽中存在极有药用价值的活性分子,有望将其开发为具有临床应用价值的候选药物先导分子。因此,对两栖动物来源的活性多肽进行研究具有重要的基础意义和应用价值。目前已经从两栖类动物中挖掘鉴定了很多多肽,但两栖类是物种丰富、数目庞大且分布广泛的一类生物,它们仍然具有巨大的开发潜力。传统的两栖动物活性多肽鉴定主要通过大量采集其皮肤分泌物进行分离纯化,而随着两栖类动物数目逐年减少,且因某些两栖类个体小,难以获得常规分离纯化方法所需要的样本量,传统的分离纯化手段已经远远不能满足高效鉴定的需求。而对蛙科进行的肽组学研究表明,蛙科动物源性多肽具有保守的前体结构,且成熟肽少有翻译后修饰,利用此特点可以使用一段以蛙科动物特有的信号肽序列设计的特异引物对其皮肤中的活性肽进行快速鉴定。在本研究中,以棕点湍蛙、大绿臭蛙为对象,通过cDNA克隆,尽可能的发掘其皮肤来源的多肽,研究相关活性,以期补充和发展两栖类活性肽分子库,同时为往后两栖类活性肽的快速发掘工作提供经验与借鉴。【方法】1.cDNA克隆:在野外采集棕点湍蛙(海拔2100～3200 m)Alpelisib纯度和大绿臭蛙(450～1200 m)的活体样本,将样本处死后分离皮肤组织提取皮肤总RNA,用一段以蛙科动物特有的信号肽序列设计的特异性引物(5‘-CCAAA(G/C)ATGTTCACC(T/A)TGAAGAAA-3’)以总RNA为模板进行PCR扩增,电泳检查扩增结果后,回收300～500bp长度的片段,测序。将测序所得序列转换、翻译为多肽序列后,通过NCBI网站进行序列搜索比对,按相似度对其进行家族归纳分类。统计了两个蛙种鉴定出的多肽总数,家族数量,新肽的占比并分析了两蛙种之间的差异,以及分析这些多肽的前体结构特点和成熟肽序列一级结构的多样性。2.新型活性多肽功能探索:采取商业合作模式固相合成了文库中的部分多肽样品(棕点湍蛙皮肤中发现的5个新家族多肽Loloensin-4-AL2、Loloensin-6-AL1、Loloensin-2-AL1、Loloensin-24-AL1、Loloensin-15-AL17;大绿臭蛙皮肤中新发现12个新家族多肽Lividin-X3-OL60、Lividin-X4-OL7、Lividin-X8-OL48、Lividin-X10-OL46、Lividin-X11-OL17、Lividin-X12-OL1、Lividin-X20-OL10、Lividin-X26-OL3、Lividin-X62-OL1、Lividin-X73-OL1、Lividin-X306-OL1和Lividin-X415-OL1),通过平板抑菌检测其抗菌活性,溶血活性,再通过ABTS~+和DPPH自由基清除实验检测多肽抗氧化能力;此外,我们还通过体外MTS实验检测了多肽样品的促细胞增殖活性,细胞划痕实验检测多肽样品的促细胞创伤修复活性;并构建小鼠全皮层缺损创伤愈合模型,在整体动物水平上进一步检测其对创伤修复的影响,结合病理MC3作用组织学分析探索这些多肽促进创伤修复可能的组织学水平作用机制。【结果】1.cDNA克隆是鉴定两栖动物皮肤活性肽的一种极为高效的手段,与传统鉴定两栖动物活性肽的方法相比,只需要较少数量的动物样本就能成功鉴定secondary endodontic infection出大量的生物活性肽前体编码分子。从单个棕点湍蛙皮肤中总计发现4610个多肽,从单个大绿臭蛙中皮肤中发现10375个多肽。2.从棕点湍蛙的皮肤中鉴定了175765个编码活性肽前体的cDNA全序列约为大绿臭蛙2倍,共编码4618个不同的活性肽前体,共计39个家族,其中包括新命名的24个新家族。从大绿臭蛙的皮肤中鉴定了79108个cDNA序列,编码10375个不同的活性肽前体,共有502个家族,其中包括新发现的415个新家族,约为棕点湍蛙20倍。3.蛙科皮肤来源的活性肽前体有着高度的结构保守性,成熟肽具有丰富的一级结构多样性,鉴定出的全部多肽中,其前体结构都满足“前导肽-中间肽-成熟肽”这样的结构。按一级结构特点,将这些多肽分为线性肽与环肽两大类,线性肽又分为含有半胱氨酸和不含半胱氨酸的多肽,此外还有数量较少的包含3个及以上半胱氨酸的多肽。与线性肽相比,全部鉴定出的多肽中环肽占据更大的数量优势,从两个蛙种鉴定出来的全部14985个活性肽中,具备分子内二硫键的环肽占到总数的50%以上,且多以已报道家族的成员出现。4.17条多肽中仅有L4-AL2检测到较弱的抗菌活性,其余16条多肽均无抗菌活性,所有多肽均未检测出溶血活性。5.L2-AL1、L24-AL1、L15-AL17、LX3-OL60、LX4-OL7、LX8-OL48、LX10-OL46、LX11-OL17、LX12-OL1、LX20-OL10、LX26-OL3、LX62-OL1、LX73-OL1、LX306-OL1和LX415-OL1在50μM浓度下都具ABTS~+自由基清除活性,且呈浓度依赖。6.在100 n M浓度下,细胞划痕实验显示LX20-OL10具有促进Ha Ca T细胞迁移的能力,LX10-OL46、LX11-OL17能促进Ha Ca T细胞增殖,L4-AL2能抑制Ha Ca T细胞增殖,此外LX3-OL60、LX4-OL7、LX8-OL48、LX10-OL46、LX11-OL17、LX26-OL3和LX62-OL1还表现出促进RAW264.7细胞增殖的能力,而动物模型与组织病理学检查均未发现其有促进小鼠创伤愈合的活性。【结论】通过cDNA克隆方法从棕点湍蛙和大绿臭蛙的皮肤中鉴定出了共计14985个活性肽前体,其中仅有24条多肽是已经被报道的,其余14969条是未被报道的新型肽。检测的17条多肽中,有16条多肽都有不同的生物活性。对蛙科动物而言,cDNA克隆方法能最大限度的减少对两栖动物样本的需求,并能高效地鉴定两栖动物皮肤活性多肽,是行之有效的快速鉴定方法,两栖动物活性肽仍然拥有巨大的开发潜力。