卵巢畸胎瘤(ovarian teratoma,OT)是最常见的女性生殖细胞肿瘤(ovarian germ cell tumors,OGCTs),其中成熟性畸胎瘤占95%,未成熟畸胎瘤占1%～3%。卵巢畸胎瘤,尤其是未成熟畸胎瘤主要见于30岁以下年轻女性及幼女,手术、化疗以及疾病复发等过程均可能对女性内分泌、生殖能力造成损害,进而给患者及其家庭带来了不可忽视的精神压力和经济负担。尽管有研究认为卵巢畸胎瘤的发病与卵母细胞孤雌激活和减数分裂异常以及卵母细胞与颗粒细胞发育协调性失衡有关,但该病的确切病因仍旧未知。近年来有研究发现在既往有卵巢畸胎瘤病史的家族中女性成熟性畸胎瘤患病率更高,从而认为其发病可能与遗传有关;在小鼠卵巢畸胎瘤模型的研究中也发现畸胎瘤的形成与多种基因的突变有关。但目前针对人类卵巢畸胎瘤遗传背景的相关研究极少,寻找该病的遗传易感基因有助于进一步了解该类疾病的病因学,并对预防及临床治疗提供重要的理论基础。本课题组在前期研究中收集到1个含2名患病成员的卵巢未成熟畸胎瘤家系。为寻找其可疑致病基因我们采用全外显子测序筛选联合SangAntimicrobial biopolymerser测序验证的方法先后在该家系中筛选并发现2个胚系突变——父源性骨形态发生蛋白15(Bone Morphogenetic Protein 15,BMP15)p.R88C错义突变和母源性钙黏蛋白相关家族成员2(Cadherin Related Family Member2,CDHR2)p.R745X无义突变——可能与家族中女性未成熟畸胎瘤的发病相关。课题组前期的研究显示BMP15基因胚系p.R88C错义突变导致其成熟蛋白分泌水平明显降低,在小鼠模型中突变可以诱导雌鼠卵母细胞孤雌激活,从而导致部分雌鼠卵巢畸胎瘤的发生。但在家系中我们发现携带BMP15p.R88C错义突变的女性并非全部发病,与家庭中未发病的女性携带者相比,两个未成熟畸胎瘤患者同时携带CDHR2基因胚系的p.R745X无义突变。CDHR2属原钙黏蛋白家族,高表达于肝脏、肾脏、结肠中,而在以上组织来源的肿瘤中低表达,在结肠癌及肝癌细胞中过表达CDHR2均可抑制肿瘤细胞的增殖。迄今为止,CDHR2及其特异性突变p.R745X与肿瘤的关系尚不清楚。本研究旨在前期研究基础上进一步探索家系中CDHR2 p.R745X与卵巢未成熟畸胎瘤的发病关系,为后续卵巢未成熟畸胎瘤的分子遗传学机制研究提供基础。拟通过以下三个步骤研究CDHR2 p.R745X无义突变的致病性及其与卵巢未成熟畸胎瘤的发病关系:(1)完善家系成员CDHR2 p.R745X的突变检测,明确系谱情况;依据美国遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)ZD1839分子式基因突变解读指南评估该变异的致病性。(2)明确CDHR2 p.R745X突变在蛋白表达水平及细胞内定位的改变情况;(3)通过基因编辑技术构建与人CDHR2 p.R745X突变相一致小鼠模型,与前期实验构建的BMP15 p.R86C点突变小鼠杂交形成CDHR2~(+/Q744X) BMP15~(+/R86C)双基因突变杂合鼠,观察雌鼠卵巢组织学改变情况,探讨CDHR2 p.R745X突变与卵巢未成熟畸胎瘤的发病关系。第一部分CDHR2 p.R745X在卵巢未成熟畸胎瘤家系的系谱研究及致病性评价目的:在家系中进行CDHR2 p.R745X突变的Sanger测序验证和系谱研究,完成该家系图谱的绘制和变异位点的致病性评价。方法:1.严格遵循相关医学伦理学要求,收集未成熟畸胎瘤家系先证者及家系其他成员静脉血,提取DNA。2.将家系成员DNA行Sanger测序,验证突变的真实性并明确变异位点与临床表型的关系及家系其他成员的携带情况,绘制系谱图。3.完成突变位点与疾病表型的共分离分析;查询Gnom AD、Ex AC、TOPMed、Gnom AD＿exome等有公信力的人群数据库以及Clinvar、db SNP和COSMIC等疾病相关数据库了解变异位点的最小等位基因频率、变异位点与疾病相关的信息登记情况;采用Mutation Taster、Combined Annotation Dependent Depletion(CADD)等在线数据库预测突变后蛋白结构及功能改变情况。4.依据ACMG基因突变解读指南综合评价CDHR2 p.R745X的致病性。结果:1.全外显子测序结果提示该家系中卵巢未成熟畸胎瘤患者均同时携带BMP15 p.R88C(CGC to TGC)错义突变和CDHR2 p.R745X(CG A to TGA)无义突变;一代测序证实了以上突变的真实性,且BMP15 p.R88C为父系来源,CDHR2 p.R745X为母系来源。该家系中单独携带以上任何一个突变者均未发病;同时携带以上突变的个体均发病。2.CDHR2 p.R745X突变与家系中卵巢未成熟畸胎瘤发病具备共分离特性;人群数据库Gnom AD、Ex AC、TOPMed、Gnom AD＿exome中显示最小等位基因频率普遍低频(最低0.000060,最高0.000108),与疾病相关的人类基因组变异数据库Clinvar中暂无该位点突变所致疾病的登记信息,而COSMIC数据库中显示该突变位点在对前列腺癌和胰腺癌的外显子测序中有发现,但无进一步研究;Mutation Taster、CADD在线数据库预测提示CDHR2 p.R745X为有害突变。3.依据ACMG基因突变解读指南综合评价CDHR2 p.R745X突变符合1个极强致病性证据、2个中等致病性证据和2个支持性致病证据,因此判定该位点的突变为“致病性突变”。结论:1.该卵巢未成熟畸胎瘤家系中存在父系来源的BMP15 p.R88C错义突变和母系来源的CDHR2 p.R745X无义突变2个胚系基因变异位点,同时携带以上胚系突变的个体均发病,推测卵巢未成熟畸胎瘤可能为多基因遗传病,为进一步寻找该病的遗传易感基因提供了重要的实验依据。2.依据ACMG基因突变解读指南评价CDHR2 p.R745X为致病性突变,推测该突变可能与家系卵巢未成熟畸胎瘤发病有关。可通过体外细胞实验验证突变对蛋白表达及亚定位的影响,来进一步验证该位点的致病性。第二部分CDHR2 p.R745X突变后蛋白表达水平及细胞亚定位的研究目的:了解CDHR2 p.R745X突变蛋白表达水平改变情况及其突变产物在细胞中的定位情况。方法:1.构建野生型和突变型CDHR2质粒,瞬时转染HEK-293T细胞。2.检测细胞转染效率合格后,分析野生型质粒组和突变型质粒组细胞CDHR2 m RNA表达差异;采用Western blot方法检测野生型质粒组和突变型质粒组细胞CDHR2蛋白水平变化。3.采用激光共聚焦成像检测野生型CDHR2和CDHR2 p.R745X突变产物在HEK-293T细胞中的定位改变。结果:1.CDHNaporafenib抑制剂R2 p.R745X突变型质粒组CDHR2 m RNA和蛋白水平均明显低于野生型质粒组,二者差异均有统计学意义(P<0.05)。2.野生型CDHR2蛋白分布于细胞膜,突变后表达产物绝大部分位于细胞质。结论:体外实验证明CDHR2 p.R745X突变改变蛋白表达和亚细胞定位,进一步证明该位点具有致病性。该突变与卵巢未成熟畸胎瘤的发病是否相关可通过动物体内实验进一步研究。第三部分CDHR2 p.R745X与卵巢未成熟畸胎瘤发病关系的体内实验研究目的:通过模拟家系致病突变携带情况,构建双基因突变杂合小鼠,观察CDHR2 p.R745X突变是否与BMP15 p.R88C突变共同导致了卵巢未成熟畸胎瘤表型,以探讨CDHR2 p.R745X与卵巢未成熟畸胎瘤发病关系。方法:1.采用CRISPR/Cas9技术构建以C57BL/6J为遗传背景的CDHR2p.Q744X基因突变模型鼠,获取CDHR2~(+/Q744X)点突变小鼠。2.与课题组前期构建的相同遗传背景的C57BL/6J BMP15~(R86C/R86C)点突变鼠杂交获得双基因突变杂合雌鼠CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)作为实验组(Mutation),野生型C57BL/6J CDHR2~(+/+)BMP15~(+/+)雌鼠作为实验对照组(Wild type)。3.取2月、4月、6月三个时间点的CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)双基因突变杂合雌鼠及同月龄对照组小鼠卵巢,观察对比二者外观形态及HE染色的石蜡切片中卵巢的组织学改变。结果:1.成功构建了CDHR2~(+/Q744X)基因编辑小鼠模型;并在建系过程中获取了CDHR2~(+/Q744X)杂合突变小鼠、CDHR2~(Q744X/Q744X)纯合突变小鼠和与BMP15~(R86C/R86C)杂交后形成的双基因突变鼠CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)。2.4月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)雌鼠卵巢体积较野生型雌鼠卵巢体积增大,差异有统计学意义(P<0.05)。2月龄和6月龄实验组与对照组卵巢体积无明显差异(P>0.05)。2月龄、4月龄、6月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)与CDHR2~(+/+)BMP15~(+/+)雌鼠苏木精-伊红(HE)染色切片镜下均未见神经管、神经上皮、软骨、皮脂腺、毛囊等畸胎瘤中常见肿瘤组织。仅6月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)雌鼠卵巢石蜡切片HE染色镜下可见1例滤泡囊肿(1/20)。3.4月、6月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)雌鼠与对照组相比卵巢内部结构混乱,各阶段生长卵泡数目明显减少,闭锁卵泡数目明显增多,部分卵泡丧失正常形态,可见双核卵母细胞(4月龄小鼠更突出)。结论:在模拟卵巢未成熟畸胎瘤家系构建和培育的CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)小鼠模型中,4月、6月龄雌鼠卵巢可见异常卵泡(4月龄明显),且4月龄雌鼠卵巢体积大于同月龄野生型雌鼠卵巢,HE切片镜下可见含形态异常卵泡,但实验组所有月龄雌鼠卵巢均未见畸胎瘤所特有的三胚层结构。CDHR2 p.R745X及BMP15p.R88C在小鼠模型中未形成卵巢畸胎瘤表型可能与小鼠模型的局限性、更多遗传易感基因和/或致病基因的参与以及基因的突变负荷等因素有关,可在未来研究中进一步探索。综上所述,本研究以卵巢未成熟畸胎瘤家系的测序结果为研究起点,依据文献结论及该家系测序发现的父源性BMP15 p.R88C错义突变和母源性CDHR2 p.745X无义突变,推测卵巢未成熟畸胎瘤可能为多基因遗传病。在前期BMP15 p.R88C体内体外研究的基础上,首先对新发现的母源CDHR2 p.745X无义突变的致病性进行了评估和体外实验验证,随后通过模拟家系构建CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)双基因突变杂合小鼠模型,观察卵巢未成熟畸胎瘤表型的形成情况,验证BMP15 p.R88C突变和CDHR2p.745X突变共同导致卵巢未成熟畸胎瘤发病的研究假设。研究发现:(1)该家系携带父系来源的BMP15 p.R88C和母系来源的CDHR2 p.R745X两个特异突变。前者的致病性前期研究已经证实,后者依据ACMG发布的基因突变指南评估为致病性突变。以上发现支持卵巢未成熟畸胎瘤的分子遗传学机制可能与多基因联合致病有关的假设。(2)体外实验证实CDHR2p.R745X突变可以降低CDHR2的蛋白表达水平,其突变产物由细胞膜转变为细胞质定位,验证了该突变导致蛋白损伤的突变效应(证据等级中的PVS1)。(3)体内实验发现各月龄CDHR2~(+/Q744X)BMP15~(+/R86C)雌鼠卵巢中均未见向外胚层、中胚层或内胚层分化的肿瘤样组织,但4月龄、6月龄雌鼠卵巢中均可见异常发育的卵泡(4月龄显著)。本研究虽然在小鼠模型中未见卵巢未成熟畸胎瘤表型形成,但为后续研究提供了以下几点启示:(1)人与小鼠之间存在的种属差异可能是导致实验中基因编辑模型鼠不能再现卵巢未成熟畸胎瘤表型的原因之一。(2)该家族性卵巢未成熟畸胎瘤的发病除以上基因突变外,还可能存在其他遗传易感基因,有待进一步探索。(3)进一步研究还需要深入考虑其他因素,如:更多遗传易感基因的参与;遗传背景不同,基因所起促癌或抑癌作用可能与差别;肿瘤负荷对研究结果的影响等。