Author: admin

目的:本研究通过利用聚氨基葡萄糖羧酸钠医用生物胶体液(术优康)对口腔颌面部间隙感染(Oral and maxillofacial space infection,OMSI)切开引流术后进行局部冲洗,观察在治疗不同时期相关炎症因子变化及临床表现,分析其治疗效果,同时探究术优康治疗OMSI是否具有局部抗菌作用,为临床上治疗OMSI加快降低相关炎症因子水平、促进创口愈合、减少患者疼痛、缩短冲洗换药时间等提供重要的理论依据。方法:选自2021年12月至2022年9月就诊于右江民族医学院附属医院口腔颌面外科,临床上确诊并符合本次病例研究标准的36例住院患者,其中男性患者19人,女性患者17人。采用局麻或全麻下行口腔颌面间隙感染切开引流术。按照随机数字表法将患者随机分为两组,实验组术优康组,对照组生理盐水组,两组患者自术后至拔管前每天行2次顺引流管低压冲洗换药。(1)利用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测Hepatic stellate cell患者术前、术后2、4、6天肘部外周静脉血肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素8(Interleukin-8,IL-8)浓度。(2)将另取血清标本送本院检验科对术前、术后2、4、6天白细胞计数(White blood cell,WBC)、超敏C反应蛋白(Hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)及降钙素原(Procalcitonin,PCT)定量检测。(3)在入院后、应用抗生素之前,利用粗针穿刺取脓液送检验科进行普通细菌培养+药敏试验。(4)对检验科普通细菌培养结果的优势菌种进行体外培养,利用纸片扩散法药敏试验检测术优康对优势菌是否具有抗菌性。(5)分析并比较两组患者年龄、性别、冲洗换药时间、术后换药期间疼痛程度等一般资料。结果:(1)两组患者一般资料对比:实验组18例,男性10例,女性8例,对照组18例,男性9例,女性9例,对两组患者性别资料进行统计学分析,统计学差异没有显著意义(χ2=0.111,P=0.738,P>0.05)。实验组平均年龄为(46.22±13.69岁),对照组平均年龄为(48.00±9.12岁)。对两组患者年龄资料进行统计学分析,统计学没有显著差异(P=0.650,P>0.05)。(2)两组患者相关炎症因子浓度比较:对两组患者术前检测WBC、hs-CRP、PCT、TNF-α、IL-8浓度进行比较,统计学均没有显著差异(P>0.05),同组在治疗不同时间点组内数据之间存在显著差异(P<0.001),在时间与组别交互作用下两组数据存在显著交互效应(P<0.05),两组在术后不同时间点组间比较存在显著差异(P<0.05)。VP-16临床试验(3)冲洗换药时间比较:实验组冲洗换药时间均值低于对照组,且统计学有显著差异(P<0.05)。(4)疼痛程度比较:两组在术后2、4、6天时非换药状态下疼痛程度比较,统计学均有显著差异(P<0.05)。(5)本研究共32例培养出细菌或真菌,4例细菌培养未见优势菌,阳性检出率为88.89%,对所检出病原微生物进行统计分析,革兰阳性菌为本次研究中数量最多病原菌27例,占75.00%,革兰阴性菌4例,占11.11%,真菌1例,占2.78%。革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌数量居首位16例(44.44%),革兰阴性菌中肺炎克雷伯菌数量最多2例(5selleckchem KD025.56%),真菌为白色念珠菌1例。(6)对病原菌阳性检出者行药敏试验,结果为金黄色葡萄球菌对青霉素药物敏感性最高;星座链球菌对头孢曲松、氨苄西林等药物敏感性较强;血液链球菌敏感性最高的药物为青霉素类、头孢类等。通过纸片扩散法药敏试验对体外培养优势菌金黄色葡萄球菌(USA300)检测发现,术优康原液纸片周围抗菌圈直径最大,1倍稀释液次之,而不同浓度康复新液与生理盐水未见抗菌圈产生。结论:(1)术优康用于OMSI术后冲洗时,通过发挥其抗炎作用能够显著降低治疗前、后相关炎症因子水平,从而加快感染控制、缩短冲洗换药时间。(2)术优康作为一种生物胶体能够改善感染组织愈合内环境,减少组织液渗出,加快组织愈合,从而减轻患者疼痛程度。(3)本研究对OMSI优势菌金黄色葡萄球菌进行体外培养,利用纸片扩散法药敏试验检测术优康对金黄色葡萄球菌具有抗菌作用,为今后临床治疗OMSI全身及局部用药提供理论依据。

目的：研究巨噬细胞外泌体mir-222对Caspase-10是否具有调控作用，以及巨噬细胞外泌体可能通过介导mir-222靶向Caspase-10的方式促进胶质瘤增殖。方法：使用mir-222 mimic转染巨噬细胞，通过巨噬细胞来源外泌体mir-222转染胶质瘤细胞，在此基础上构建Caspase-10immune parameters表达载体。使用RT-PCR检测巨噬细胞和胶质瘤细胞mir-222的表达；使用CCK-8检测胶质瘤细胞增殖活力；使用双荧光素酶验证mir-222与Caspase-10基因的靶向结合，使用Weselleck激酶抑制剂stern blot检测Caspase-10的表达。结果：透射电镜观察到巨噬细胞来源外泌体直径约100 nm的球形结构形态；mir-222 mimic处理显著促进巨噬细胞mir-222的表达；巨噬细胞来源外泌体mir-222能促进胶质瘤细胞mir-222的表达和增殖；mir-222与Caspase-10存在靶向结合关系；mir-222 mimic显著抑制了CasRepSox供应商pase-10的表达。结论：巨噬细胞来源外泌体mir-222通过靶向结合下调Caspase-10的表达，在胶质瘤细胞增殖中起到重要作用。

近些年来,随着人口老龄化的加剧,骨质疏松等疾病导致骨缺损的人数越来越多,尽管骨组织有PEG300说明书一定的自我修复能力,但是当骨组织缺损处过大时无法愈合,因此,寻找一类合适的骨组织工程支架材料尤为重要。随着医用生物材料的evidence informed practice发展,诸多学者发现无论是金属材料、高分子材料还是无机材料单独使用都有一定的缺陷,不能完全符合理想材料的所有性能,所以需要设计出理想且适合人体的骨组织工程支架。二水磷酸氢钙(DCPD)作为医用陶瓷材料的一种,具有良好的生物相容性,相比羟基磷灰石,具有更优的降解性。但是传统的DCPD不具备抗菌性能。本文采用引入银离子对其进行改性,使其具有抗菌性能并与氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM)/壳聚糖(CS)有机材料复合制备出具有良好抗菌性能、机械性能、降解性能的多孔骨组织工程支架,具体如下:(1)采用共沉积法制备出抗菌二水磷酸氢钙(ADCPD),通过XRD、SEM及抗菌性能测试等方法进行分析。结果表明银离子并不会改变原有DCPD的形貌和晶体结构,且随着银离子含量的增加,抑菌性能显著提升,抑菌最小浓度为3%,且ADCPD对大肠杆菌的抑制效果要大于金黄色葡萄球菌。(2)利用过氧化氢对魔芋葡甘聚糖氧化,得到氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM),使其具有醛基结构,与壳聚糖(CS)氨基相结合发生席夫碱反应制成水凝胶。对OKGM/CS水凝胶进行测试表征,利用FT-IR分析魔芋葡甘聚糖的氧化反应和与CS发生的席夫碱反应,通过凝胶时间、机械性能测试等实验探究出OKGM:CS最佳质量比1:1。(3)以ADCPD、OKGM、CS为原料,通过挤出成型法制备出具有直通孔阵列的抗菌骨组织工程支架。其孔隙率在50%以上,孔径主要尺寸在400μm左右(人骨单位的平均大小约223μm)。支架的多孔结构有利于血管的生成和营养物质输送。抗菌多孔支架的抗压强度可达7 MPa以上。体外降解三个月左右,支架的抗压强度始终大于2 MPa,满足人体RAD001试剂松质骨抗压强度的最小要求,并且降解率在50%～60%,不会发生垮塌。实验证明支架具有良好的抗菌性能,无细胞毒性。本实验制备的抗菌多孔骨组织工程支架具有良好的抗菌性能、力学性能、体外降解性能和多孔结构,有望应用于骨修复领域。

糖脂代谢紊乱是多种代谢性疾病的核心病理机制,目前还没有公认的方法和药物来全面改善和治疗,临床常用的降糖降脂药物长期用药的副作用都较大,急需寻求新的治疗药物。HCV核心蛋白结合蛋白(Hepatitis C virus core-binding protein6;HCBP6)是近年来新发现的可调控糖、脂肪合成的重要靶点,其在机体中的表达与甘油三酯及胆固醇密切相关,它会根据二者含量的变化调整自身分泌。已有文献报道,人参皂苷Rh2能诱导HCBP6表达,有效改善糖脂代谢紊乱,但是Rh2为稀有皂苷,含量极低,至今不能全合成,成药可行性低。临床实践和现代研究表明,人参、三七、苦瓜、绞股蓝、青钱柳、玉竹、罗汉果和黄精8味中草药均具有良好的调节糖脂代谢作用,而皂苷类成分是其活性成分。因此,本文拟以以上8味中草药为研究对象,以HCBP6为主要作用靶点,利用蛋白建模及分子对接等虚拟筛选技术,从8味中药中筛选潜在活性化合物并加以验证,以期发现疗效确切、机制明确的调节糖脂代谢的的先导化合物。目的:以新发现的HCBP6蛋白为主要作用靶点,通过蛋白建模、虚拟筛选和体内外试验相结合,从8味常用中草药中筛选具有调节糖脂代谢作用的疗效确切、机制明确的先导化合物。方法:采用细胞试验,通过PCR和WB检测考察以上8味中药总皂苷部位对HCBP6基因和蛋白质的调控作用。利用数据库和文献报道,收集整理8味中药中的皂苷和苷元成分,构建小分子库。分别通过SWISS同源建模法、trRosetta从头建模法、I-TASSER穿线法以及ROBETTA综合法预测HCBP6蛋白结构,用于虚拟筛选。为了提高筛选的可靠性,同步选择与HCBP6密切相关的具有调节糖脂代谢作用的5个关键靶点(AMPK、FXR、FoxO1、SIRTMedical apps1、FGF21)用于虚拟筛选。在PDB数据库中搜索以上5个关键蛋白名称后,选择分辨率高,结构内含有与皂苷类化合物具有相似结构的小分子配体的蛋白受体结构作为受体结构。使用Discovery Studio软件中CDOCKER模式或LibDock模式将上述小分子库中的分子结构和以上6个蛋白结构进行分子对接,筛选得到潜在活性成分。利用游离脂肪酸和单糖建立体外糖脂代谢紊乱模型,筛选最佳造模条件。采用优选的最佳造模条件建立HepG2体外糖脂代谢紊乱模型,通过测定甘油三酯含量和葡萄糖消耗量,检测虚拟筛选得到的潜在活性分子的体外活性,并就测定结果进行构效关系分析。通过高糖高脂饲料喂养构建C57BL/6J小鼠糖脂代谢紊乱模型,对体外试验中筛选得到的活性分子再经体内试验进行进一步的活性验证,监测小鼠体重、死亡情况,对其空腹血糖、脏器比及生化指标进行检测。最后通过PCR 及 WB 试验检测活性成分对 HCBP6、SREBP1、SREBP2、GLUT1、GLUT4、G6pase及PEPCK的mRNA和蛋白表达的影响,以阐释其作用机制。结果:1.与对照组相比,8味中药总皂苷部位在10mg·mL-1浓度下均对细胞生长无显著影响,而且绞股蓝、三七和人参总皂苷在高浓度下还表现出促进细胞生长的作用。PCR实验结果显示,与对照组比较,人参1 000μg·mL-1组,苦瓜200 μg·mL-1 组,绞股蓝 50、200、1000 μg·mL-1 组以及三七 100 μg·mL-1 组 HCBP6基因表达显著升高(P<0.05);比较而言,绞股蓝总皂苷组上调HCBP6基因的作用最好。WB检测结果显示,与对照组相比,人参500、1 000μg.mL-1组可显著上调HCBP6蛋白的表达(P<0.05),其他不同浓度的7种中药总皂苷均可使HCBP6蛋白的表达增加,但差异并不显著。各药物组对HCBP6 mRNA及蛋白表达均未表现出明显的剂量依赖性。2.经过去重处理后,共从8味中药中收集整理了 1308个皂苷及苷元类成分,建立了皂苷类成分小分子库。四种蛋白建模方法比较,ROBETTA综合法预测的HCBP6蛋白结构最合理,其3D-1D评分高于0.2的氨基酸占比为85.19%(>80%代表结构合理),Ramachandran图中处于合理区域的氨基酸占比为95.1%(>90%代表结构合理),可用于下一步试验。利用DS软件,以CDOCKER模式或LibDock模式进行分子对接,共筛选得到193个潜RAD001体内实验剂量在活性小分子,包括130个三萜,63个甾体;三萜中有52个苷元,78个皂苷;甾体中有31个苷元,32个皂苷。3.囿于对照品的可及性和经费的限制,从虚拟筛选获得的193个化合物中共选择了 59个成分用于体外活性验证。HepG2细胞糖脂代谢紊乱模型的最佳造模条件为:1mM油酸+0.5mM棕榈酸+10mM葡萄糖+15mM果糖作用24h即可。体外活性实验结果表明,24个化合物(包括21个三萜,3个甾体)可显著减少细胞内TG的含量(P<0.01);49个化合物(包括38三萜,11个甾体)可显著提高葡萄糖的消耗量(P<0.05);共有23化合物可同时降低细胞内TG含量并显著提高葡萄糖的消耗量。最终筛选得到14个体外活性成分,分别是:ergosta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol(1)、人参皂苷 Rb3(3)、gypenoside Ⅸ(5)、23,24-二氢葫芦素F-25-乙酸酯(12)、葫芦素B(14)、葫芦素Q1(15)、人参皂苷 Rh4(20)、人参皂苷 Rh2(21)、3,29-二苯甲酰基栝楼仁二醇(24)、KaravilosideⅪ(42)、人参皂苷Rg6(43)、人参皂苷Rk2(44)、人参皂苷Rb2(49)及人参皂苷Rk1(52)。构效关系分析结果表明,三萜类化合物不管在数量还是作用上均优于甾体类化合物;皂苷类成分在整体效果上优于皂苷元;达玛烷型四环三萜类化合物可能在糖脂代谢类疾病防治中更有优势;皂苷类化合物中,3位、6位、20位有无糖取代及糖的类型对药效有不同影响;三萜皂苷元的3位羟基被羰基取代时,化合物活性会减弱。PCR结果显示,以上14个活性化合物均可显著降低HCBP6mRNA表达量(P<0.01);除化合物12、20外,其余化合物均可显著降低 G6pase、PEPCK mRNA 表达量(P<0.01);化合物 1、3、12、20、43、44、49、52可显著增加GLUT1 mRNA的表达量(P<0.01);除化合物20外,其余化合物均可不同程度降低SREBP1、SREBP2 mRNA表达量(P<0.01)。WB结果显示,化合物1、3、42、43、52所有浓度均可减少HCBP6表达,统计无显著性差异;化合物3、5、12、14、20、42所有浓度均可显著上调GLUT1蛋白表达(P<0.01);化合物14、15、20所有浓度均可显著上调GLUT4表达(P<0.01);化合物12、15、20所有浓度均可显著下调SREBP1表达(P<0.01);化合物5、14、15、20、49所有浓度均可显著下调SREBP2表达(P<0.01);除化合物15以及44外,其他化合物所有浓度均可显著下调PEPCK表达(P<0.01);化合物3、12、15、21、42、43、49所有浓度均可显著下调G6pase表达(P<0.01)。4.同样囿于对照品的可及性和经费的限制,从14个细胞试验证明有活性的化合物中选择其中的7个成分[gypenoside Ⅸ(5)、23,24-二氢葫芦素F-25-乙酸酯(12)、葫芦素B(14)、葫芦素Q1(15)、3,29-二苯甲酰基栝楼仁二醇(24)、人参皂苷Rg6(43)、人参皂苷Rk2(44)]用于体内药效评价。采用高糖高脂饲料饮食诱导C57BL/6J小鼠糖脂代谢紊乱模型进行体内活性评价,分为空白组、模型组、二甲双胍组(200mg·kg-1)、以及受试物高剂量(60mg·kg-1)和低剂量(30mg·kg-1)组。造模成功后,连续给药1个月,监测小鼠体重和死亡情况,每周检测空腹血糖,给药结束后检测脏器比和生化指标,结果显示14号化合物(葫芦素B)高、低剂量组小鼠全部死亡;二甲双胍组和15号化合物组体重降低最多;12、24、43和44号化合物组体重增加明显;除化合物5高低剂量、12低剂量及43高剂量组外,全部给药组均有显著降糖作用(P<0.05);除化合物12高剂量、24低剂量及44低剂量组外,全部给药组均有显著降脂作用,但差异无统计学意义。与模型组相比,15号化合物(葫芦素Q1)有显著降糖降脂作用(P<0.05);但肝功、肾功指标及脏器比结果显示,15GSK J4使用方法对小鼠有明显的肝肾毒性,其余给药组未见肝肾毒性。此外,脾、胸腺脏器比结果显示,化合物24、43可改善小鼠免疫功能。PCR及WB试验结果表明,与模型组比较,除12、15号之外的其他5个成分均可上调HCBP6mRNA及蛋白表达,其中化合物24、43、44的上调有统计学意义(P<0.05);化合物43可显著上调G6pase mRNA及蛋白表达(P<0.05);所有给药组均可下调SREBP1和SREBP2 mRNA及蛋白表达(P<0.01);除化合物15外,所有给药组对GLUT1及GLUT4 mRNA及蛋白表达量均有增加趋势,但差异无统计学意义。结论:1.人参、三七、苦瓜、绞股蓝、青钱柳、罗汉果、玉竹和黄精的总皂苷部位均有上调HCBP6基因和蛋白表达的作用,通过干预HCBP6的表达而发挥调节糖脂代谢作用可能是这8味中药发挥药效的机制之一。2.通过蛋白建模-分子对接-体内外活性验证从人参等8味中药中筛选得到3个具有调节糖脂代谢的先导化合物,分别是3,29-二苯甲酰基栝楼仁二醇(24)、人参皂苷Rg6(43)和人参皂苷Rk2(44)。

野鸟是A型流感病毒的自然储存宿主,在A型流感病毒的传播和遗传进化中起到Urban biometeorology了至关重要的作用。A型流感病毒宿主范围广泛,能够感染多种JQ1采购家禽,猪、马、水貂等哺乳动物和人类,给公共卫生造成极大的威胁。辽宁省位于东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上,是候鸟迁徙中的重要休憩地也是野鸟流感病毒监测的重点区域。H6亚型禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)在1965年首次从美国火鸡中分离。1972年我国台湾省首次发现H6亚型AIV。自2002年以来,H6亚型AIV成为中国南方活禽市场中流行的主要亚型之一。目前,H6亚型AIV已具备感染多种哺乳动物的能力,但相关分子机制还有待研究。本研究于2021年在辽宁省开展的野鸟AIV监测中,分离到一株H6N2亚型AIV,命名为A/wild bird/Liaoning/DD535(LN/DD535)。遗传进化分析发现,这株H6N2亚型野鸟AIV的七个基因片段属于欧亚谱系,而M基因属于北美谱系,因此LN/DD535为跨洲际重组毒株。全基因组序列分析发现,LN/DD535存在多个与哺乳动物适应性相关的氨基酸位点突变。生物学特性分析发现,LN/DD535可在小鼠体内有效复制,对小鼠呈低致病性。在感染小鼠的肺脏中发现哺乳动物适应性突变株,PB2蛋白627位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸,HA蛋白110位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸。突变毒株在小鼠体内复制能力较亲本毒株增强。本研究在辽宁省候鸟监测过程中分离到一株跨洲际重组H6N2亚型野鸟AIV。此株H6N2亚型AIV具SCH727965有小鼠适应性,且对小鼠呈低致病性。病毒感染小鼠后获得哺乳动物适应性突变。本研究证明H6N2亚型野鸟AIV对哺乳动物宿主适应性增强,应加强对辽宁省野鸟AIV监测力度,为辽宁省AIV防控提供预警信息。

目的 收集全国真菌病监测网四川省中心真菌血流感染数据，整理分析病原菌分布特点及抗真菌药物敏感性情况，为四川省真菌血流感染提供流行病学数据。方法 研究28家医院2019年1月1日—2021年12月31日门急诊及住院患者真菌血流感染的数据，采用Whonet 5.6及Microsoft Excle数据透视表功能分析真菌血流感染的临床资料及实验室信息。结果 2019年1月1日—2021年12月31日28家医院上报数据中的1 220株真菌中，念珠菌属占88.8%(1 083/1 220),以白念珠菌为主，占35.3%(431/1 220);新生隐球菌位于总分离株数的第5位，占8.3%(101/1 220)。男性占比56.6%(690/1220),女性患者Z-VAD-FMK分子式相比较少(43.4%,530/1 220);其中中老年患者(>46岁)79.8%,34.8%来自于重症监护室。白念珠菌对氟康唑的敏感性最高(85.7%);热带念珠菌对氟康唑和伏立康唑的耐药率分别为43.4%和43.3%,且逐年上升。分离的101株新生隐球菌对两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑均存在不同的非野生株，比例分别为5.0%、2.5%、11.8%、5.7%和8.5%;每家医院分离病原菌的数量排序存在一定差异，大resolved HBV infection多数医院以白念珠菌为主，但儿童专科性医院近平滑念珠菌分离数最多。结论 真菌血流购买LY294002感染病原菌及其抗真菌药物敏感性存在地域性特点，准确掌握所在地区病原菌流行病学资料可以为临床选择抗真菌药物提供依据。

为探讨全氟烷基化合物(PFAImmune evolutionary algorithmS)暴露与成年人抑郁症发生风险的关系,合并2005～2018年美国国家营养与健康调查数据(NHANES),共纳入5424名男性和5438名女性.通过加权logistic回归分析模型和限制性立方样条,研究了全氟辛基羧酸(PFOA)、全氟辛基磺ZD1839生产商酸(PFOS)、全氟己基磺酸(PFHxS)和全氟壬酸(PFNA) 4种PFAS暴露与成年人抑郁症发生风险的关联,并进一步按性别、年龄亚组分析.在此网站调整所有协变量后,较高的PFOA、PFOS、PFHx S和PFNA暴露可显著降低抑郁发生风险,与Q1相比,PFOA、PFOS、PFHxS和PFNA的最高暴露水平组(Q4)的OR值分别为0.519 (95%CI:0.367～0.735)、0.612 (95%CI:0.422～0.887)、0.608 (95%CI:0.422～0.875)和0.658 (95%CI:0.467～0.927);限制性立方样条分析表明,PFAS暴露与抑郁的患病率均呈负向线性剂量—反应关系.亚组分析发现,PFAS暴露与抑郁的负向关联分别在女性和18～39岁人群中更显著.综上,PFAS暴露与成年人抑郁患病风险呈负向关联,并表现出性别与年龄差异,但仍需进一步研究证实.

血红白叶藤(Cryptolepis sanguinolenta(Lindl.)Schlechter)是广泛分布在非洲的传统草药,在西非传统医药中占有重要地位,其具有抗炎、降血脂、抗菌、抗疟、抗肿瘤等多种药理作用。近年来,课题组对血红白叶藤的主要有效成分新白叶藤碱、白叶藤碱和异白叶藤碱等进行了系统的结构优化与抗菌活性评价研究,并首次发现了新白叶藤碱对植物病原真菌具有良好的抗菌活性,以此为先导化合物,通过结构衍生与优化后得到了抗菌谱更广、抗菌活性更优和毒性更低的候选化合物Z24。据此,本论文旨在研究和明晰候选先导化合物Z24对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)的作用机制及其靶标,为进一步生物合理性设计基于新白叶藤碱类生物碱的抗菌剂奠定基础。本研究以B.cinerea Pers.为供试菌株,通过DACeralasertib生产商RTS和LC-MS/MS联用技术对Z24的直接作用靶标进行鉴定,并借助酶学、抗体制备、分子对接、转录组学、可变剪接、代谢组学和外源施加代谢物等手段对鉴定得到的疑似靶标蛋白进行了系统深入的研究。研究的主要内容和结果如下:1、新白叶藤碱衍生物Z24为高效、低毒的抗真菌剂体外活性研究结果发现,相较新白叶藤碱而言,Z24对4种重大植物病原真菌表现出更加优异的抗真菌活性,其中Z24对B.cinerea Pers.的抗菌活性最优(EC_(50)=0.56μg/m L),优于阳性对照药嘧霉胺(EC_(50)=4.45μg/m L)。在活体实验中,Z24在100μg/m L浓度下能够显著抑制B.cinerea Pers.对番茄果实的侵染,具有较好的保护作用。盆栽实验中,100μg/m L Z24显著抑制B.cinerea Pers.对黄瓜叶片的侵染,其保护作用可达到与嘧霉胺相当的防治效果。与此同时,Z24能够浓度依赖性抑制B.cinerea Pers.孢子的萌发,并诱导孢子中活性氧的积累。Z24也显著诱导了B.cinerea Pers.菌丝细胞的凋亡,并造成菌丝细胞膜的完整性丢失和细胞显微结构的破坏。此外,Z24在HIEC细胞、HL7702细胞和GES-1细胞中具有比新白叶藤碱更低的细胞毒性,其中在HIEC细胞和GES-1细胞中的毒性低于嘧霉胺。大鼠急性经口毒性LD_(50)>2000 mg/kg,并且2000 mg/kg Z24未造成大鼠组织病理学的改变,也未引起大鼠血清中碱性磷酸酶、谷草转氨酶、尿素氮和谷丙转氨酶肝肾损伤指标的异常变化。最后,Z24也表现出相对较低的植物毒性。2、基于DARTS和LC-MS/MS技术获得了Z24作用于灰葡萄孢菌的疑似靶标蛋白Bcthi4采用DARTS、考马斯亮蓝染色、银染和质谱分析等技术手段鉴定出了Z24的直接作用靶标蛋白-硫胺噻唑合酶(Bcthi4),其中Bcthi4蛋白在鉴定列表中相对丰度占比为37.11%。随后利用docking法验证了Z24与Bcthi4同源蛋白有较好的结合能力,对接评分为-4.302 Kcal/mol。KEGG分析发现,Z24富集到的这类蛋白主要参与代谢途径、次级代谢产物的生物合成、核糖体、抗生素的生物合成、不同环境中微生物的代谢、碳代谢、氨基酸的生物合成、糖酵解/糖原异生和丙酮酸代谢等生物过程。3、确证了灰葡萄孢菌Bcthi4蛋白为Z24的直接作用靶标蛋白在靶标蛋白的确证中,首先通过参考Gen Bank已公布的B.cinerea B05.10Bcthi4基因序列(Gene ID:5430120)设计引物,利用PCR技术扩增灰葡萄孢菌Bcthi4基因后连接至p ET-B2M亚克隆载体,构建了重组质粒Bcthi4-p ET-B2M。将Bcthi4-p ET-B2M质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导培养后获得了纯度较高的Bcthi4重组蛋白。动物免疫后,经间接ELISA和Western blotting检测发现,制备所得的灰葡萄孢菌Bcthi4基因兔多克隆抗体具有灵敏度高和特异性强的特性,可用于下一步的Western blotting检测。然后通过Western blotting法对Z24和Bcthi4的结合反应进行了特异性检测,为此,我们设计并应用了CETSA和DARTS技术确认了Z24与Bcthi4蛋白的结合反应,发现Z24与Bcthi4蛋白具有较好的结合活性,且具有浓度依赖性。此外,0.05μg/m L和0.1μg/m L Z24能显著抑制B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10 Bcthi4活性。综上所述,通过Western blotting和ELISA等方法的联合验证,证实硫胺噻唑合酶(Bcthi4)确实为Z24的直接作用靶点。4、Z24通过影响硫胺素焦磷酸与Bcthi4核糖开关的结合来调控硫胺素代谢Bcthi4作为硫胺素生物合成途径中的核糖开关位点,在真菌中是通过可变剪接的方式进行基因的表达调控。差异可变剪接基因的KEGG Pathway分析发现,富集最显著的通路确实为硫胺素代谢途径,并且有3个差异可变剪接基因富集到硫胺素代谢通路,包括Bcthi4、Bcthi6和Bcrpb8,表明它们在硫胺素代谢中发挥关键作用。值得注意的是,负责硫胺素噻唑环合成的核糖开关Bcthi4中检测到了显著上调的可变剪接事件(Alternative Splicing,AS),且呈现A5SS剪接模式,表明Z24处理引起灰葡萄孢菌基因Bcthi4前体m RNA的选择性剪接,并造成Bcthi4前体m RNA剪接的增加。此外,灰葡萄孢菌在Z24胁迫生长过程中诱导了靶标基因Bcthi4的高水平表达,表明菌丝细胞处于硫胺素饥饿的状态,通过提高硫胺素合成相关基因的表达水平才能够部分恢复灰葡萄孢菌的生长,其作用方式与市售真菌剂戊唑醇类似。上述结果表明,Z24通过影响TPP与Bcthi4核糖开关的结合来进一步调控灰葡萄孢菌的硫胺素代谢过程。5、Z24是一种硫胺素生物合成通路的抑制剂向含有Z24的Pinfections: pneumoniaDA平板和PD水培养基中外源施加硫胺素后显著降低了Z24对B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10的抑制活性,而硫胺素本身不能够促进灰葡萄孢菌的生长,从而表明Z24是一种硫胺素生物合成通路的抑制剂。此外,B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10在Z24胁迫生长下均发生密集生长后,菌丝细胞内硫胺素及其活性形式硫胺素焦磷酸随化合物浓度的增加呈现不断积累的变化趋势,表明菌丝细胞是处于硫胺素饥饿的状态,只有通过积累硫胺素等代谢产物才能够恢复灰葡萄孢菌的生长。此外,非靶向代谢组学表明,硫胺素代谢异常进一步影响了灰葡萄孢菌的次生代谢物的生物合成、氨基酸生物合成、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、ABC转运蛋白、氨基酰基-t RNA生物合成等生物过程。6、基于虚拟筛选获得了潜在的Bcthi4小分子抑制剂灰葡萄孢菌Bcthi4蛋白的三维结构目前还未被解析,通过前期的文献调研发现,Bcthi4的Alpha Fold预测三维结构评分为70分以上的占比很高,表明Alpha Fold预测的结构可靠性良好(Alpha Fold ID:AF-A0A384JNK6-F1)。因此,通过Bcthi4的Alpha Fold预测结构(其结合口袋选自Bcthi4蛋白与底物的结合口袋,其关键氨基酸为CYS89/GLU110/GLY118/VAL183/HIS234/MET286等)进行计算机虚拟筛选。通过Schr?dinger软件的Lig Prep Module模块将78.8 K个化合物的2D格式进行加氢、能量优化等处理,输出3D结构进行虚拟筛选,最终获得了与靶蛋白Bcthi4结合力强的Top 200小分子化合物。将打分前5名化合物(Z1601701772、Z2506212851、Z1738460435、HY-Q01831、HY-Q03084)与Bcthi4蛋白的结合模式进行2D、3D作图,进一步分析两者间的相互作用模式VX-765和预测小分子配体的生物活性,为进一步探索基于Bcthi4蛋白的全新化学实体的设计合成与抗真菌药物开发奠定基础。

血红白叶藤(Cryptolepis sanguinolenta(Lindl.)Schlechter)是广泛分布在非洲的传统草药,在西非传统医药中占有重要地位,其具有抗炎、降血脂、抗菌、抗疟、抗肿瘤等多种药理作用。近年来,课题组对血红白叶藤的主要有效成分新白叶藤碱、白叶藤碱和异白叶藤碱等进行了系统的结构优化与抗菌活性评价研究,并首次发现了新白叶藤碱对植物病原真菌具有良好的抗菌活性,以此为先导化合物,通过结构衍生与优化后得到了抗菌谱更广、抗菌活性更优和毒性更低的候选化合物Z24。据此,本论文旨在研究和明晰候选先导化合物Z24对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)的作用机制及其靶标,为进一步生物合理性设计基于新白叶藤碱类生物碱的抗菌剂奠定基础。本研究以B.cinerea Pers.为供试菌株,通过DACeralasertib生产商RTS和LC-MS/MS联用技术对Z24的直接作用靶标进行鉴定,并借助酶学、抗体制备、分子对接、转录组学、可变剪接、代谢组学和外源施加代谢物等手段对鉴定得到的疑似靶标蛋白进行了系统深入的研究。研究的主要内容和结果如下:1、新白叶藤碱衍生物Z24为高效、低毒的抗真菌剂体外活性研究结果发现,相较新白叶藤碱而言,Z24对4种重大植物病原真菌表现出更加优异的抗真菌活性,其中Z24对B.cinerea Pers.的抗菌活性最优(EC_(50)=0.56μg/m L),优于阳性对照药嘧霉胺(EC_(50)=4.45μg/m L)。在活体实验中,Z24在100μg/m L浓度下能够显著抑制B.cinerea Pers.对番茄果实的侵染,具有较好的保护作用。盆栽实验中,100μg/m L Z24显著抑制B.cinerea Pers.对黄瓜叶片的侵染,其保护作用可达到与嘧霉胺相当的防治效果。与此同时,Z24能够浓度依赖性抑制B.cinerea Pers.孢子的萌发,并诱导孢子中活性氧的积累。Z24也显著诱导了B.cinerea Pers.菌丝细胞的凋亡,并造成菌丝细胞膜的完整性丢失和细胞显微结构的破坏。此外,Z24在HIEC细胞、HL7702细胞和GES-1细胞中具有比新白叶藤碱更低的细胞毒性,其中在HIEC细胞和GES-1细胞中的毒性低于嘧霉胺。大鼠急性经口毒性LD_(50)>2000 mg/kg,并且2000 mg/kg Z24未造成大鼠组织病理学的改变,也未引起大鼠血清中碱性磷酸酶、谷草转氨酶、尿素氮和谷丙转氨酶肝肾损伤指标的异常变化。最后,Z24也表现出相对较低的植物毒性。2、基于DARTS和LC-MS/MS技术获得了Z24作用于灰葡萄孢菌的疑似靶标蛋白Bcthi4采用DARTS、考马斯亮蓝染色、银染和质谱分析等技术手段鉴定出了Z24的直接作用靶标蛋白-硫胺噻唑合酶(Bcthi4),其中Bcthi4蛋白在鉴定列表中相对丰度占比为37.11%。随后利用docking法验证了Z24与Bcthi4同源蛋白有较好的结合能力,对接评分为-4.302 Kcal/mol。KEGG分析发现,Z24富集到的这类蛋白主要参与代谢途径、次级代谢产物的生物合成、核糖体、抗生素的生物合成、不同环境中微生物的代谢、碳代谢、氨基酸的生物合成、糖酵解/糖原异生和丙酮酸代谢等生物过程。3、确证了灰葡萄孢菌Bcthi4蛋白为Z24的直接作用靶标蛋白在靶标蛋白的确证中,首先通过参考Gen Bank已公布的B.cinerea B05.10Bcthi4基因序列(Gene ID:5430120)设计引物,利用PCR技术扩增灰葡萄孢菌Bcthi4基因后连接至p ET-B2M亚克隆载体,构建了重组质粒Bcthi4-p ET-B2M。将Bcthi4-p ET-B2M质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导培养后获得了纯度较高的Bcthi4重组蛋白。动物免疫后,经间接ELISA和Western blotting检测发现,制备所得的灰葡萄孢菌Bcthi4基因兔多克隆抗体具有灵敏度高和特异性强的特性,可用于下一步的Western blotting检测。然后通过Western blotting法对Z24和Bcthi4的结合反应进行了特异性检测,为此,我们设计并应用了CETSA和DARTS技术确认了Z24与Bcthi4蛋白的结合反应,发现Z24与Bcthi4蛋白具有较好的结合活性,且具有浓度依赖性。此外,0.05μg/m L和0.1μg/m L Z24能显著抑制B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10 Bcthi4活性。综上所述,通过Western blotting和ELISA等方法的联合验证,证实硫胺噻唑合酶(Bcthi4)确实为Z24的直接作用靶点。4、Z24通过影响硫胺素焦磷酸与Bcthi4核糖开关的结合来调控硫胺素代谢Bcthi4作为硫胺素生物合成途径中的核糖开关位点,在真菌中是通过可变剪接的方式进行基因的表达调控。差异可变剪接基因的KEGG Pathway分析发现,富集最显著的通路确实为硫胺素代谢途径,并且有3个差异可变剪接基因富集到硫胺素代谢通路,包括Bcthi4、Bcthi6和Bcrpb8,表明它们在硫胺素代谢中发挥关键作用。值得注意的是,负责硫胺素噻唑环合成的核糖开关Bcthi4中检测到了显著上调的可变剪接事件(Alternative Splicing,AS),且呈现A5SS剪接模式,表明Z24处理引起灰葡萄孢菌基因Bcthi4前体m RNA的选择性剪接,并造成Bcthi4前体m RNA剪接的增加。此外,灰葡萄孢菌在Z24胁迫生长过程中诱导了靶标基因Bcthi4的高水平表达,表明菌丝细胞处于硫胺素饥饿的状态,通过提高硫胺素合成相关基因的表达水平才能够部分恢复灰葡萄孢菌的生长,其作用方式与市售真菌剂戊唑醇类似。上述结果表明,Z24通过影响TPP与Bcthi4核糖开关的结合来进一步调控灰葡萄孢菌的硫胺素代谢过程。5、Z24是一种硫胺素生物合成通路的抑制剂向含有Z24的Pinfections: pneumoniaDA平板和PD水培养基中外源施加硫胺素后显著降低了Z24对B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10的抑制活性,而硫胺素本身不能够促进灰葡萄孢菌的生长,从而表明Z24是一种硫胺素生物合成通路的抑制剂。此外,B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10在Z24胁迫生长下均发生密集生长后,菌丝细胞内硫胺素及其活性形式硫胺素焦磷酸随化合物浓度的增加呈现不断积累的变化趋势,表明菌丝细胞是处于硫胺素饥饿的状态,只有通过积累硫胺素等代谢产物才能够恢复灰葡萄孢菌的生长。此外,非靶向代谢组学表明,硫胺素代谢异常进一步影响了灰葡萄孢菌的次生代谢物的生物合成、氨基酸生物合成、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、ABC转运蛋白、氨基酰基-t RNA生物合成等生物过程。6、基于虚拟筛选获得了潜在的Bcthi4小分子抑制剂灰葡萄孢菌Bcthi4蛋白的三维结构目前还未被解析,通过前期的文献调研发现,Bcthi4的Alpha Fold预测三维结构评分为70分以上的占比很高,表明Alpha Fold预测的结构可靠性良好(Alpha Fold ID:AF-A0A384JNK6-F1)。因此,通过Bcthi4的Alpha Fold预测结构(其结合口袋选自Bcthi4蛋白与底物的结合口袋,其关键氨基酸为CYS89/GLU110/GLY118/VAL183/HIS234/MET286等)进行计算机虚拟筛选。通过Schr?dinger软件的Lig Prep Module模块将78.8 K个化合物的2D格式进行加氢、能量优化等处理,输出3D结构进行虚拟筛选,最终获得了与靶蛋白Bcthi4结合力强的Top 200小分子化合物。将打分前5名化合物(Z1601701772、Z2506212851、Z1738460435、HY-Q01831、HY-Q03084)与Bcthi4蛋白的结合模式进行2D、3D作图,进一步分析两者间的相互作用模式VX-765和预测小分子配体的生物活性,为进一步探索基于Bcthi4蛋白的全新化学实体的设计合成与抗真菌药物开发奠定基础。

由于环境污染、资源短缺,在化学品的生产过程中,绿色环保的微生物法将逐渐取代传统的化学法。酵母细胞作为性能优良的底盘菌株,由于其具有成熟的遗传操作体系和良好的鲁棒性已被广泛地用于生物燃料、生物材料和生物医药等高价值化学品的生产。在酵母细胞生产化学品的过程中,生长性能、代谢状态和胁迫耐受性是决定其生产能力的关键性指标。本论文以酵母细胞胁迫耐受性为切入点,基于组学分析、表型分析和生理功能分析,分别通过解析Med2在低pH胁迫环境中的分子机制、优化细胞骨架蛋白形态增强酵母抵御盐胁迫、设计人工无膜细胞器封存有毒中间代谢产物、调节人工无膜细胞器减少代谢负担等策略,增加酵母细胞在胞外和胞内胁迫下的耐受能力,有效改善了酵母生产化学品的能力。具体结果如下:1.解析Med2在低pH胁迫环境中的分子作selleck NMR用机制:以光滑球拟酵母为研究对象,首先,通过转录组、代谢组以及遗传表型分析等手段,明确了Med2通过介导转录因子Yap6来响应低pH胁迫;然后,进一步解析发现,在低pH胁迫下,Yap6会被蛋白激酶Yak1磷酸化,使Yap6从细胞质转移到细胞核中与Med2发生相互作用,从而强化甘油磷脂相关基因的表达,并以此增加细胞膜的完整性;最终,通过过表达Med2使光滑球拟酵母的总甘油磷脂含量、膜完整性和最终生物量分别提高了24.7%,12.1%和12.4%;2.优化细胞骨架蛋白形态增强酵母抵御盐胁迫:以酿酒酵母为研究对象,首先,经过适应性进化和转录组分析,确定了耐受盐胁迫的关键靶点为Cyk2与Rvs167;然后,过表达Cyk2与Rvs167发现,酵母中的骨架蛋白曲率降低了27.6%,骨架蛋白密度增加了107.2%;最后,利用启动子工程优化Cyk2与Rvs167的表达强度,发现当Cyk2中等强度表达与Rvs167高等强度表达时,酿酒酵母在盐胁迫条件下的出芽率提高了45.9%,生物量提高了81.7%;3.设计人工无膜细胞器封Cholestasis intrahepatic存有毒中间代AMG510分子量谢产物:以酿酒酵母无膜细胞器为研究对象,首先,基于文献挖掘和表型分析,筛选形成无膜细胞器的无序蛋白结构域,确定了A-IDPs在液滴饱和浓度、温度稳定性和细胞生长方面具有显著优势。然后,基于蛋白组装单元和蓝光激活单元构建了无膜细胞器尺寸调节系统。最后,利用无膜细胞器尺寸调节系统操纵工程菌株ZP03-FM(包含甲醇同化路径和苹果酸合成路径)中甲醇同化无膜细胞器的尺寸,降低了甲醛的泄露,使得甲醇消耗量和苹果酸产量分别提高了162.2%和61.7%。4.调节人工无膜细胞器刚性减少代谢负担:首先利用荧光漂白恢复、1,6-己二醇溶解以及物质交换分析,发现朊病毒蛋白结构域(s PFD)可以对无膜细胞器的刚性进行调节。然后,基于蛋白组装单元和蓝光激活单元构建了无膜细胞器刚性调节系统。最后,在生产正丁醇的工程菌株中引入无膜细胞器刚性调节系统作为代谢阀门,使乙酰辅酶a的合成从氧化性糖酵解切换为非氧化性糖酵解,最终使二氧化碳的释放量减少了35.2%,正丁醇的产率增加了27.3%。