Author: admin

以天香百合（Lilium auratum）和药百合（L. speciosum var. gloCNS infectionriosoides）为研究材料，分别克隆获得黄酮醇合成酶（flavonol synthase， FLS）基因，命名为LaFLS和LsFLS。实验结果表明，LaFLS和LsFLS基因均含完整的开放阅读框1 035 bp，均编码344个氨基酸，氨基酸序列高度保守，均具有DIOX-N结构域和2-酮戊二酸和铁(Ⅱ)依赖性双加氧酶结构域，属于2-酮戊二酸和铁(Ⅱ)依赖性双加氧酶超家族；系统进化分析表明，LaFLS和LsFLS除与东方系百合西伯利亚和索邦的FLS亲缘关系最近外，与百合科郁金香（Tulipa fosteriana）等亲缘关系较近；生物信息学分析显示，LaFLS和LsFLS蛋白无信号肽序列和跨膜结构域，均为BLZ945采购亲水性蛋白，亚细胞定位结果显示二者主要定位在细胞质中。MLN8237纯度基因表达分析结果表明，在花蕾发育过程中，LaFLS和LsFLS随花蕾发育出现先上升后下降再上升的趋势，而且在花被片无色区的表达量显著高于有色区域。

目的:1.明确三七总皂苷(PNS)对脑缺血再灌注损伤(CIRI)中铁死亡和炎症反应的调控作用。2.基于Nrf2负性调控铁死亡途径揭示PNS抗脑缺血再灌注炎症损伤作用机制。方法:1.明确PNS对Erastin和氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡的调控作用。体外分别构建AG-221供应商Erastin和OGD/R诱导的细胞铁死亡模型,实验分对照组,模型组,PNS低、中、高剂量组,铁死亡抑制剂(Fer-1)组、铁螯合剂(DFO)组;通过CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测评价各组细胞损伤程度;检测Fe~(2+)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)以及活性氧(ROS)等铁Genetic affinity死亡关键指标的变化。2.明确PNS对中动脉闭塞/复灌注(MCAO/R)大鼠脑组织中铁死亡和炎症反应的作用。构建MCAO/R诱导的大鼠CIRI模型,实验分假手术组,MCAO/R组,PNS低、中、高剂量组,Fer-1组,DFO组;缺血2h复灌24h后,通过神经功能缺损评分、平衡木、攀绳肌力、黏贴片移除、圆筒实验的行为学指标以及TTC染色检测评价脑损伤程度;试剂盒检测Fe~(2+)、GSH、MDA以及脂质过氧化物(LPO)等铁死亡关键指标的变化,运用Western blot检测铁死亡主要调控蛋白水平。试剂盒检测白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及髓系过氧化物酶(MPO)等炎症相关指标的水平。3.揭示PNS通过活化Nrf2抑制铁死亡减轻脑缺血再灌注炎症损伤的作用机制。构建OGD/R诱导的细胞模型以及MCAO/R诱导的大鼠模型,实验分假手术组,模型组,Nrf2激动剂组,PNS高剂量组,Nrf2抑制剂组,PNS+Nrf2抑制剂联用组;通过免疫荧光检测各组细胞中Nrf2的入核情况;Western blot检测各组大鼠脑组织中Nrf2总蛋白、核蛋白及胞浆蛋白水平。通过试剂盒检测炎症及铁死亡相关指标,Western blot检测铁死亡调控路径关键蛋白的表达水平,神经功能缺损评分、行为学以及TTC染色检测评价各组大鼠脑损伤程度。结果:1.CCK-8和LDH漏出率检测结果显示:与对照组比较,Erastin和OGD/R模型组细胞活性显著下降,LDH漏出率显著升高;与模型组比较,PNS、Fer-1和DFO组均阻断了上述变化。铁死亡检测显示:与对照组比较,Erastin和OGD/R模型组细胞内Fe~(2+)、MDA、ROS含量显著增加,GSH含量显著减少;与模型组比较,PNS、Fer-1和DFO组细胞内Fe~(2+)、MDA、ROS含量显著降低,GSH含量显著增加。2.TTC染色结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组右侧大脑呈现大片体积白色脑梗死区域;与MCAO/R模型组比较,PNS、Fer-1与DFO组白色脑梗死体积显著减少。神经功能评分与行为学结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组大鼠神经功能缺损评分显著增高,贴纸移除时间显著增加,平衡木评分、圆筒实验患侧肢体利用率、攀绳测试评分及时间显著降低;与MCAO/R组比较,PNS、Fer-1与DFO组神经功能缺损评分显著降低,贴纸移除时间显著减少,平衡木评分、圆筒实验患侧肢体利用率、攀绳测试评分及时间显著增加。铁死亡检测结果显示:与假手术组比较,MCAO/R大鼠脑组织中Fe~(2+)、MDA与LPO含量显著增加,GSH含量获悉更多显著减少;与MCAO/R组比较,PNS、Fer-1与DFO组Fe~(2+)、MDA与LPO含量显著降低,GSH含量显著增加;Western blot实验结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组大鼠脑组织中酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)蛋白水平显著增加,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)及重组溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的蛋白水平显著降低;与MCAO/R组比较,PNS、Fer-1与DFO组ACSL4蛋白水平均显著降低,GPX4及SLC7A11的蛋白水平显著增加。炎症相关指标检测结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO含量显著增高;与MCAO/R组比较,PNS、Fer-1与DFO组IL-1β、IL-6、TNF-α及MPO含量均显著降低。3.细胞免疫荧光实验结果显示:与对照组比较,OGD/R组的Nrf2入核水平显著增加;与OGD/R组比较,PNS与Nrf2激动剂组的Nrf2入核水平进一步增加;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组的Nrf2入核水平显著降低。另外,大鼠脑组织Western blot检测结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组大鼠脑组织中Nrf2总蛋白与核蛋白水平显著升高,Nrf2胞浆蛋白水平显著降低;与MCAO/R组比较,PNS与Nrf2激动剂组中Nrf2总蛋白与核蛋白水平进一步升高,Nrf2胞浆蛋白水平进一步降低;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组Nrf2总蛋白与核蛋白水平显著降低,Nrf2胞浆蛋白水平显著升高。铁死亡检测结果显示:与MCAO/R组比较,PNS和Nrf2激动剂组Fe~(2+)、MDA、LPO含量显著减少,GSH含量显著增加;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用显著逆转了以上效应。Western blot实验结果显示:与MCAO/R组比较,PNS和Nrf2激动剂组运铁蛋白(FPN)和铁蛋白重链(FTH)以及GPX4、SLC7A11的蛋白水平显著增加;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组铁死亡相关蛋白水平显著降低。炎症相关指标检测结果显示:与MCAO/R组比较,PNS与Nrf2激动剂组IL-1β、IL-6和TNF-α以及MPO含量显著减少;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组炎症因子及MPO含量显著增高。最后,脑损伤检测的结果显示:与MCAO/R组比较,PNS与Nrf2激动剂组显著降低脑梗死体积和神经功能缺损评分,显著缓解运动功能障碍。与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组脑梗死体积增加,神经功能缺损症状和运动感觉障碍加重。结论:1.PNS抑制Erastin和OGD/R诱导的铁死亡减轻细胞损伤。2.PNS抑制MCAO/R大鼠脑组织铁死亡和脑缺血再灌注炎症反应。3.PNS通过活化Nrf2抑制铁死亡减轻脑缺血再灌注炎症损伤。

研究背景葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma,UM)是起源于葡萄膜的高侵袭性肿瘤,多发于成年人眼球后极部,严重损害患者视功能和生命健康。尽管50%的UM会发生转移,但是对于体积较小的UM,发生远处转移的风险极低。因此,对于UM患者来说,要做到早期诊断和及早干预,减少远端血行转移的可能性,以确保更完整的视觉功能和更长的生命存续期。当前,UM眼部治疗措施为个性化治疗,根据肿瘤的位置、体积、临床特征以及患者的基本情况选择合适的治疗措施。治疗的目的是实现对肿瘤的局部控制并降低病理转移的风险,同时最大限度保留眼球完整性和眼睛视功能。常用的UM眼部治疗方法有放射治疗、局部手术治疗、经瞳孔温热疗法(Transpupillary thermotherapy,TTT)和光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)等。巩膜外敷贴放疗(External scleral plaque radiotherapy,PRT)是目前最常用的放射治疗方式,与经眼球摘除术的患者相比,经PRT治疗的患者可以保留有用的视力和完整的眼球,并且预后无明显差异。但是,PRT非常依赖外科医生的手术操作,并且巩膜外放射物极易损伤肿瘤周围健康组织,出现白内障、新生血管性青光眼以及视网膜脱离等并发症。局部切除术可以完整的切除Ubiomedical detectionM肿瘤组织并尽可能的保留眼球的完整性,同时也可以获得新鲜组织标本进行后续诊断和基因检测。但是,肿瘤局部切除术难度较大,对手术医生的技术和手术经验要求较高,并且肿瘤局部切除术极易造成肿瘤细胞播散。TTT和PDT主要作为放疗的备选方案,临床疗效有限,并且存在潜在的并发症。故探讨和研究新的UM眼部治疗方式具有重要意义。化学动力疗法(Chemodynamic therapy,CDT)是一类新型的肿瘤治疗技术,自2016年被提出后引起广泛关注。与以往传统肿瘤诊疗技术不同,CDT依靠肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)自身化学产物发生转化反应,发挥抗肿瘤作用。传统的CDT的核心是由二价铁离子(Fe2+)等过渡金属离子构成的纳米材料,催化TME中过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2),发生芬顿反应(或类芬顿反应),产生具有强氧化能力的羟基自由基(Hydroxyl radical,·OH),导致肿瘤细胞脂质过氧化、蛋白失活等,最终导致细胞死亡。在正常组织内,H2O2含量低,无法和纳米材料反应产生足够的·OH,展现出良好的生物相容性,CDT在肿瘤治疗方面展现出良好的应用潜力有望用于UM的治疗。但是,常用的过渡金属纳米材料催化效能有限,体内降解性低,存在潜在的长期毒性。需要开发尺寸更小,可生物降解且具有高效芬顿催化反应活性的CDT纳米材料用于UM的局部治疗。在我们之前的研究中,我们通过自行设计的一种简单快速的“微爆法”,成功制备了非氧化 MXene-Ti3C2Tx 量子点(MXene-Ti3C2Tx quantum dots,NMQDs-Ti3C2Tx)。NMQDs-Ti3C2Tx具有超小的粒子尺寸,平均横向直径为7.23nm,平均厚度为5nm。与Fe2+相比,NMQDs-Ti3C2Tx具有优异的类芬顿催化性能。NMQDs-Ti3C2Tx对宫颈癌、乳腺癌展现出了强大的杀伤作用,此外,NMQDs-Ti3C2Tx在生物体内也展现出了良好的生物相容性。但是,NMQDs-Ti3C2Tx对UM肿瘤的作用以及NMQDs-Ti3C2Tx在眼内的生物相容性目前未知,尚无相关文献报道。在本研究的第一部分,我们拟从NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移等生物学行为的影响入手,探讨NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞的影响以及具体的作用机制;在第二部分,我们讨论NMQDs-Ti3C2Tx在体内UM模型中的作用,并且进一步探讨其对正常眼内细胞的毒性作用和眼内生物相容性。通过我们的研究,为UM的临床早期治疗提供新的治疗方式和思路。第一部分NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞生物学行为的影响以及对UM细胞作用机制的研究研究目的肿瘤的增殖、克隆形成、侵袭和迁移等生物学行为导致了肿瘤的发生和转移,本部分旨在研究NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞生物学的影响,并进一步探究NMQDs-Ti3C2Tx在UM细胞内的作用机制。研究方法1.制备 NMQDs-Ti3C2Tx首先,我们通过传统刻蚀法制备NMQDs-Ti3C2Tx的原材料MXene-Ti3C2Tx,并使用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)对 MXene-Ti3C2Tx 进行表征;之后,我们利用液氮和高温去离子水的温差产生“微爆”来制备NMQDs-Ti3C2Tx,并使用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)对 NMQDs-Ti3C2Tx 进行表征。2.实验细胞的培养及处理本实验使用人UM细胞系:C918和MUM-2B,两种细胞系均使用含有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的RPMI-1640培养基,培养于37℃含有5%二氧化碳(Carbon dioxide,CO2)的细胞培养箱中。主要处理如下:将制备好的NMQDs-Ti3C2Tx配置成水溶液与UM细胞共培养,从而分析和观察NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞生物学行为的影响。3.UM细胞活力检测使用CCK-8法检测细胞活力。将C918和MUM-2B细胞分别给予不同浓度的NMQDs-Ti3C2Tx(浓度梯度为 0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL 和200μg/mL)刺激,于12小时、24小时和36小时后在UM细胞中加入CCK-8试剂,最后使用酶标仪测定吸光度。4.UM细胞克隆形成实验将C918和MUM-2B细胞分别给予不同浓度的NMQDs-Ti3C2Tx水溶液(与CCK-8实验相一致),每3天进行一次换液,14天后,收集细胞统计克隆数,计算克隆率。5.UM细胞活/死染色实验使用0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL 的 NMQDs-Ti3C2Tx 刺激 C918 和MUM-2B细胞,6小时后使用活/死细胞染色试剂对Uselleck HPLCM细胞进行染色,观察UM细胞活细胞和死细胞情况,结合CCK-8试验结果,为下一步实验确定实验浓度和刺激时间。6.划痕实验和Transwell实验使用0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL 的 NMQDs-Ti3C2Tx 刺激 C918 和 MUM-2B 细胞,6小时后收集细胞进行划痕实验和Transwell实验,观察NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞迁移和侵袭能力的影响。7.UM细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和脂质过氧化物检测将C918细胞和MUM-2B细胞与NMQDs-Ti3C2Tx共培养。6个小时后,分别使用ROS检测荧光探针(H2DCFDA)和脂质过氧化荧光探针(C11 BODIPY 581/591)标记UM细胞,最后进行流式细胞学实验检测ROS以及脂质过氧化物含量。更多8.UM 细胞内丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞6小时后,使用细胞裂解液提取UM细胞总蛋白,使用BCA试剂盒测定蛋白浓度,之后使用MDA检测试剂盒进行MDA检测。9.UM细胞内谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量检测使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞,6小时后收集细胞,使用GSH检测试剂盒检测GSH。10.UM细胞线粒体膜电位(Membrane potential,MMP)检测将C918细胞和MUM-2B细胞与NMQDs-Ti3C2Tx共培养。6小时后,使用MMP检测荧光探针(TMRM)对细胞进行染色,然后进行流式细胞学实验检测MMP变化。11.UM细胞线粒体及溶酶体形态检测使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞,6小时后收集并使用电镜固定液固定细胞。使用透射电子显微镜观察线粒体及溶酶体形态。12.UM细胞内NMQDs-Ti3C2Tx与线粒体和溶酶体共定位检测使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞1小时后,加入线粒体红色荧光探针(Mito-Tracker Red)标记UM细胞线粒体,使用荧光显微镜观察NMQDs-Ti3C2Tx与线粒体共定位情况。使用溶酶体红色荧光探针(Lyso-Tracker Red)标记UM细胞的溶酶体,观察NMQDs-Ti3C2Tx与溶酶体共定位情况。13.定量实时荧光PCR(qPCR)使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞1小时后,提取细胞总RNA,使用逆转录试剂盒进行RNA反转录,然后通过qPCR获取目的基因SLC7A11、PTGS2和LC3的Ct值,以GAPDH为内参基因,计算SLC7A11、PTGS2和LC3的表达水平。14.数据统计及分析所有实验至少重复3次,所得数据使用软件GraphPad Prism 7进行统计、分析及绘图。P值小于0.05具有统计学差异。研究结果1.使用“微爆法”成功制备NMQDs-Ti3C2Tx我们使用SEM对所制备的MXene-Ti3C2Tx进行表征,发现MXene-Ti3C2Tx具有MXene典型的“手风琴”样结构;使用TEM对所制备NMQDs-Ti3C2Tx进行表征,发现NMQDs-Ti3C2Tx具有规则的“类圆盘样”形状,表明NMQDs-Ti3C2Tx制备成功。2.NMQDs-Ti3C2Tx抑制UM细胞的增殖和克隆形成CCK-8结果显示,与NMQDs-Ti3C2Tx共培养后,C918和MUM-2B细胞的增殖和克隆形成受到明显抑制,并随着NMQDs-Ti3C2Tx浓度的增加,抑制效果越明显。结合活/死细胞染色结果,在后续的实验中,为避免细胞死亡对实验结果的影响,选用50μg/mL和100μg/mL作为NMQDs-Ti3C2Tx的实验浓度,6小时作为刺激时间。3.与NMQDs-Ti3C2Tx共培养后,UM的侵袭和迁移能力受到抑制使用 0μg/mL、50μg/mL 及 100μg/mL 的 NMQDs-Ti3C2Tx 刺激 UM 细胞 6 小时,收集细胞后进行划痕实验和Transwell实验,结果显示,与对照组(0μg/mL)相比,NMQDs-Ti3C2Tx明显抑制了 C918和MUM-2B细胞的侵袭和迁移能力。4.NMQDs-Ti3C2Tx破坏UM细胞内氧化还原稳态使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918和MUM-2B细胞6小时后,与对照组(0μg/mL)相比,UM细胞内的总ROS含量升高,脂质过氧化程度升高;此外,GSH含量也明显下降,提示NMQDs-Ti3C2Tx破坏了 UM细胞内氧化还原稳态。5.NMQDs-Ti3C2Tx导致UM细胞发生铁死亡qPCR结果显示,加入NMQDs-Ti3C2Tx后,C918和MUM-2B细胞内的SLC7A11和PTGS2基因的mRNA水平上调,并且UM细胞线粒体嵴减少,线粒体膜断裂,提示经过NMQDs-Ti3C2Tx刺激之后,UM细胞发生了铁死亡。6.NMQDs-Ti3C2Tx导致UM细胞线粒体稳态破坏通过对C918和MUM-2B细胞内的线粒体进行标记,我们发现NMQDs-Ti3C2Tx与UM细胞内的线粒体共定位。提示NMQDs-Ti3C2Tx可能直接作用于UM细胞内线粒体;通过进一步分析UM细胞内的MMP,我们发现NMQDs-Ti3C2Tx刺激后,UM细胞内MMP明显降低,提示线粒体受到损伤;我们进一步使用透射电镜直接观察线粒体形态,我们发现线粒体形态发生明显改变,说明NMQDs-Ti3C2Tx导致线粒体稳态破坏。7.NMQDs-Ti3C2Tx导致UM细胞溶酶体破坏通过qPCR,我们发现UM细胞内自噬相关LC3基因mRNA水平上调。通过透射电镜,我们在自噬溶酶体内发现损伤的线粒体,这些结果提示NMQDs-Ti3C2Tx刺激后,UM细胞发生了线粒体自噬。在自噬溶酶体内,我们发现了黑灰色颗粒并且自噬溶酶体膜完整性遭到破坏;通过对UM细胞内的溶酶体进行标记,我们发现NMQDs-Ti3C2Tx与UM细胞内的溶酶体共定位,说明NMQDs-Ti3C2Tx在溶酶体内代谢,自噬溶酶体内黑灰色颗粒为溶酶体吞噬的NMQDs-Ti3C2Tx,NMQDs-Ti3C2Tx在溶酶体酸性环境下进一步反应,破坏了自噬溶酶体。实验结论1.NMQDs-Ti3C2Tx可以明显抑制UM细胞(C918和MUM-2B)增殖,克隆形成,侵袭和迁移等生物学行为;2.NMQDs-Ti3C2Tx通过破坏UM细胞氧化还原平衡导致铁死亡;3.NMQDs-Ti3C2Tx攻击UM细胞线粒体,导致线粒体损伤和线粒体自噬;4.NMQDs-Ti3C2Tx破坏溶酶体,终止线粒体自噬,加剧细胞死亡。第二部分NMQDs-Ti3C2Tx对裸鼠体内UM发生的影响以及其在眼内生物相容性的研究研究目的第一部分中,我们在体外实验中发现NMQDs-Ti3C2Tx通过影响UM细胞的氧化还原代谢、线粒体稳态等机制抑制了 UM细胞的增殖,克隆形成,侵袭和迁移等生物学行为。但是,NMQDs-Ti3C2Tx在体内对UM肿瘤的影响未知。本部分通过构建UM裸鼠肿瘤模型,进一步观察NMQDs-Ti3C2Tx对UM肿瘤的影响;此外,通过将NMQDs-Ti3C2Tx 与视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium,RPE)共培养,观察NMQDs-Ti3C2Tx对正常眼内细胞的作用;通过玻璃体腔注射NMQDs-Ti3C2Tx,观察其在眼内的生物相容性。研究方法1.实验动物使用BALB/c裸鼠构建UM皮下肿瘤模型;使用C57BL/6小鼠进行眼内注射。2.实验动物分组选取4周龄的雌性BALB/c裸鼠8只,将C918细胞悬液注射于裸鼠皮下成瘤。之后随机分为两组进行药物注射(每2天注射一次),每组4只:对照组(生理盐水),实验组(NMQDs-Ti3C2Tx水溶液)。选取4周龄的雌性C57BL/6小鼠6只进行眼内药物注射,随机分为两组,每组3只:对照组(生理盐水),实验组(NMQDs-Ti3C2Tx水溶液)。3.实验细胞的培养及处理本实验所使用C918细胞系,培养同第一部分;人ARPE-19细胞系,使用含有10%FBS的DMEM培养基,培养于含有5%CO2的细胞培养箱中。主要处理如下:将NMQDs-Ti3C2Tx与ARPE-19细胞共培养,分别于12小时、24小时以及36小时进行CCK-8实验,观察NMQDs-Ti3C2Tx对ARPE-19细胞增殖的影响;将NMQDs-Ti3C2Tx与ARPE-19细胞共培养6小时后,进行流式细胞学分析,观察ARPE-19细胞内的ROS、脂质过氧化物以及MMP的变化。4.裸鼠体重和瘤体体积测量每次药物注射前使用电子天平称量裸鼠的体重,每只测量3次取平均值作为最终体重数据;使用游标卡尺测量瘤体长短径,并计算瘤体体积。5.C57BL/6小鼠玻璃体腔注药C57BL/6小鼠麻醉后,眼部滴用表面麻醉剂并散瞳,使用29G手术针角膜缘后做巩膜切口,汉密尔顿微量注射器进行玻璃体腔药物注射。术后3天,对小鼠进行眼底光学相干断层扫描(Optical Coherence Tomography,OCT)。6.组织取材实验结束后,给予小鼠安乐死,留取裸鼠瘤体以及C57BL/6小鼠眼球。部分组织置入液氮内速冻,之后转入-80℃冰箱内长期保存;部分组织放入4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)固定,以备后续使用。7.组织病理学检测对裸鼠瘤体以及C57BL/6小鼠眼球制备组织切片,并进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,H&E)染色。8.数据统计及分析对实验所得数据进行整理,使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析及绘图,P值小于0.05具有统计学差异。研究结果1.NMQDs-Ti3C2Tx抑制UM皮下荷瘤的增殖。通过裸鼠皮下荷瘤实验,我们发现,实验组瘤体的体积和重量明显小于对照组瘤体的体积和重量。通过对瘤体组织H&E染色,我们发现实验组肿瘤注射部位附近出现大片坏死,而远离注射部位的瘤体组织没有受到影响。2.NMQDs-Ti3C2Tx不影响ARPE-19细胞的活力。通过CCK-8实验,我们发现,即使使用200μg/mL的NMQDs-Ti3C2Tx刺激ARPE-19细胞36小时,ARPE-19细胞的活力没有受到明显的影响。通过活/死染色实验,我们也没有观察到明显的死细胞产生。3.NMQDs-Ti3C2Tx不影响ARPE-19细胞氧化还原代谢和线粒体稳态。通过流式细胞学分析,ARPE-19细胞经过NMQDs-Ti3C2Tx刺激之后,细胞内的总ROS以及脂质过氧化物含量没有升高;并且,NMQDs-Ti3C2Tx对ARPE-19细胞的MMP没有明显影响。4.NMQDs-Ti3C2Tx对小鼠眼内组织没有明显破坏作用。小鼠眼内注射NMQDs-Ti3C2Tx后,我们通过OCT分析发现,实验组和对照组小鼠眼底图像没有明显差异,视网膜厚度也没有发生明显改变;我们进一步通过H&E染色发现,两组小鼠眼球切片细胞形态规则,没有明显差异。实验结论1.NMQDs-Ti3C2Tx具有强大的破坏肿瘤的能力,可以明显抑制裸鼠注射部位UM肿瘤的生长。2.NMQDs-Ti3C2Tx对RPE细胞没有毒性作用且在眼内有良好的生物相容性。

【目的】探究肺癌患者化疗与脑区血脑屏障通透性及认知水平的关系,为肺癌患者化疗相关认知障碍寻找神经病理解剖定位。【材料与方法】前瞻性收集昆明医科大学第三附属医院2021年4月-2022年5月共89个参与者的临床资料和颅脑磁共振动态增强影像资料,参与者包括肺癌化疗组31名、肺癌非化疗组36名、基线情况相似的健康对照组22名。在磁共振扫描前患者完成认知水平评估。采用Patlak药代动力学模型计算BBB通透性。测量各参与者双侧额中叶、海马旁回、前扣带和旁扣带回、内侧和旁扣带回、后扣带回、楔前叶脑区的BBB通透性。比较各组间各脑区的BBB通透性及认知水平。将单因素线性回归分析有统计学意义的因素纳入多因素线性回归以确立影响脑区BBB及认知功能的独立因素。分析脑区BBB通透性与蒙特利尔认知评估量表(Mo CA)评分、简易精神状态检查量表(MMSE)评分的相关性。【结果】相比于健康对照组或肺癌非化疗组,肺癌化疗组右楔前叶的BBB透性均显著性增高(Z=2.756,P=0.018;Z=2.480,P=0.039),肺癌非化疗组与健康对照组右楔前叶BBB通透性的差异无统计学意义(Z=0.593,P=1.000)。相比于健康对照组,肺癌化疗组左后扣带回的BBB透性显著性增高(Z=2.612,P=0.027),而肺癌非化疗组左后扣带回的BBB通透性与之差异无统计学意义(Z=2.054,P=0.120);与肺癌非化疗组相比,肺癌化疗组左后扣带回的BBB通透性差异Herbal Medication无统计学意义(Z=0.703,P=1.000)。相比于健康对照组或肺癌非化疗组,肺癌化疗组的Mo CA评分均显著性减低(Z=-3.640,P=0.001;Z=-2.686,P=0.022),肺癌非化疗组与健康对照组间Mo CA评分差异无统计学意义(Z=-1.317,P=0.563)。相比于健康对照组,肺癌化疗组的MMSE评分显著性降低(Z=-2.466,P=0.041),而肺癌非化疗组MMSE评分与之差异无显著性(INCB28060说明书Z=-0.430,P=1.000),肺癌化疗组与肺癌非化疗组的MMSE差异无统计学意义(Z=-2.330,P=0.059)。肺癌化疗组患者认知障碍表现为视觉空间执行功能、延迟记忆力、抽象能力及注意力的下降(P<0.05)。在肺癌患者中,单因素及多因素线性回归分析表明化疗、BMI、肿瘤位置对右楔前叶BBB通透性的影响有统计学意义(P<0.05),化疗、学历水平对Mo CA评分的影响有统计学意义(P<0.05)。单因素与多因素线性回归表明各因素对左后扣带回的影响无统计学意义(P>0.0CP-690550分子式5)。肺癌化疗组右楔前叶BBB通透性与Mo CA评分、MMSE评分呈负相关(r=-0.539,P=0.002;r=-0.417,P=0.020)。【结论】1、化疗会引发肺癌患者右楔前叶BBB功能及认知功能损伤。2、右楔前叶BBB通透性与肺癌化疗患者认知水平呈负相关。

目的：探讨温肺化纤颗粒是否通过调节铁死亡改善肺纤维化的发生。方法：将50只昆明小鼠随机分为对照组、模型组、温肺化纤颗粒低剂量（WFHXL）组、温肺化纤颗粒中剂量（WFHXMRegorafenib体外）组和温肺化纤颗粒高剂量（WFHXH）组。除对照组外，余各组予以气管内滴注博来霉素（5 mg/kg）进行肺纤维化造模。造模后，温肺化纤颗粒低、中、高剂量组小鼠分别给予2.925、5.85、11.7 g/kg温肺化纤颗粒混悬液灌胃，对照组和模型组予以0.1 mCL13900 NMRL/10 g的生理盐水灌胃，连续28 d。末次灌胃24 h后，采用HE和Masson染色观察小鼠肺脏病理损伤；Real-time PCR检测小鼠肺脏Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表达；ELISA检测肺脏组织中GSH、Fe、MDA含量；免疫组化检测肺脏组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白含量。结果：与对照组比较，模型组小鼠肺泡间隔增厚、肺泡结构明显损坏，可见明显的蓝色胶原纤维沉积，肺脏组织MDA和Fe含量明显升高（P<0.01）,GSH含量明显降低（P<0.01）;Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表达明显降低（P<0.01）;Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平明显减少。与模型组比，温肺化纤颗粒各剂量组小鼠肺泡间隔增厚减轻、肺泡结构损坏减轻，肺脏中蓝色胶原纤维沉积减少，温肺化纤颗粒低、中、高剂量组小鼠肺脏组织中MDA和Fe含量明显降低（P<0.01）,GSH含量明显升高（P<0.01）,antibiotic pharmacistNrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平明显升高。结论：温肺化纤颗粒具有改善肺纤维化作用，其作用机制可能通过调节铁死亡，进而达到减轻肺脏组织损伤的效果。

目的:评估四环单结调整缝线引流管结扎技术在Ahmed青光眼阀(AGV)植入术中的应用效果。方法:回顾性分析。纳入2020-05/2022-01本院眼科中心进行AGV植入术治疗的难治性青光眼患者78例78眼，按手术方式分为改良AGV植入术组(43眼，使用四环单结调整缝线对引流管进行结扎)和传统AGV植入组(35眼，不使用四环单结调整缝线对引流管进行结扎)。随访6mo,观selleckchem CP-456773察两组患者术后1d, 1、2wk, 1、6mo眼压，手术成功率和并发症发生情况。结果:两组患者术后1d, 1、2wk, 1、6mo眼压均较术前明显降低(均P<0.05);两组组间各时间点眼压比较均无差异(均P>0.05)。术后1wk,改良ATypes of immunosuppressionGV植入术组和传统AGV植入组浅前房发生率分别为5%和23%(P<0.05)。术后6mo,改良AGV植入术组总体成功率为98%,传统AGV植入组为89%(P>selleck CCRG 810450.05)。结论:AGV植入术中采用四环单结调整缝线结扎引流管可以有效降低眼压，减少术后早期浅前房的发生率，手术安全有效。

目的 采用全域扫频源光相干断层扫描血管成像(SS-OCTA)探讨不同分层、不同区域增生型糖尿病视网膜病变(PDR)患眼视网膜毛细血管无灌注区(NPA)的分布特征。方法 将2021年12月至2022年1月在潍坊医学院附属医院眼科确诊的PDR患者21例(26眼)纳入本研究。采用图湃(北京)医疗科技有限公司生产的BM-400K行全域SS-OCTA检查，采集患者视网膜浅层毛细血管层(SCP)和深层毛细血管层(DCP)图像。每层均按照两种方法分区：(1)以黄斑中Roxadustat MW心凹中点为圆心分为不同的圆环区域，以中央直径1 mm的圆为黄斑中心凹无血管区，直径1～<3 mm为最内环，3～<6 mm为内环，6～<10 mm为中环，≥10 mm至视网膜边界为外环(由于最内环毛细血管是相连的无缝网络且被重叠灌注，不易形成NPA,因此本次主要检测和比较内环、中环和外环的NPA);(2)以黄斑中心凹中点作selleck Talazoparib水平线和垂直线，将视网膜分为颞上、颞下、鼻上、鼻下四个象限。分别测量内环、中环、外环及四个象限的NPA面积并计算缺血指数(ISI),比较PDR患眼SCP、DCP不同圆环区域和不同象限的NPA面积和ISI,分析NPA分布特征。结果 PDR患眼DCP NPA总面积[(124.340±54.971)mm~2]大于SCP[(119.119±55.279)mm~2],DCP总ISI(Medulla oblongata0.423 0±0.187 0)大于SCP总ISI(0.405 0±0.188 0),差异均有统计学意义(均为P<0.001)。SCP、DCP外环NPA面积大于中环，中环大于内环，差异均有统计学意义(均为P<0.05);SCP、DCP外环ISI大于中环，中环大于内环，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。SCP、DCP颞下象限NPA面积大于鼻上象限，差异均有统计学意义(均为P<0.05),其余象限比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05);SCP、DCP颞下象限ISI大于鼻上象限，差异均有统计学意义(均为P<0.05),其余象限比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论 PDR患眼视网膜NPA分布不均衡，在DCP、外环和颞下象限具有更多的NPA。

目的:肺癌发病率在我国恶性肿瘤中位居首位,其中肺腺癌是主要病理类型。随着医学的发展,酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKIs)对于EGFR突变型的患者有良好的疗效,但是在治疗的后期,大多数EGFR突变型的患者会对TKIs产生一定程度的耐药性。有研究表明,化疗可提高患者在耐药后的总生存(Overall survival,OS)。所以对于肺腺癌患者,化疗是不可或缺的手段。遗憾的是,众多肺腺癌患者在化疗后会出现耐药现象,严重影响了化疗的疗效和患者的预后,因此化疗敏感性的降低已成为临床上治疗肺腺癌的主要障碍。本研究旨在探讨影响肺腺癌患者化疗敏感性的关键基因及相关机制,并进一步研究其对肺腺癌患者预后的影响,建立预后模型,从而预测肺腺癌患者的生存时间。方法:1.在GEO数据库中下载了A549细胞系化疗处理后的基因表达数据,利用MCC、MNC及Bottle Neck三种方法进行差异基因分析。2.通过q RT-PCR、细胞增殖抑制实验(MTS法)和Western blot等细胞实验探索其影响肺腺癌患者化疗敏感性的相关机制。3.从GEO数据库选择了39名接受化疗的肺腺癌患者,通过绘制K-M曲线来分析PGK1与化疗疗效的关系。4.从TCGA数据库中收集肺腺癌患者数据,匹配临床信息后,纳入了450例患者的样本。首先根据患者EFGR突变与否,将其分成EGFR突变型和野生型两部分人群,进行PGK1表达分析。随后通过单因素COX以Microtubule Associat抑制剂及多因素COX回归分析筛选出OS独立影响因素;并根据中位值,将PGK1分成高表达和低表达组进行K-M曲线分析其与肺腺癌患者临床病理特征的关系。同时利用R语言,观察关键因子在不同分期中表达量的差异情况;最后建立结合PGK1表达及肿瘤分期的预后模型,从而预测肺腺癌患者的生存时间。P<0.05被认为具有显著的统计学差异。结果:1.PGK1与肺腺癌患者化疗敏感性相关。我们利用MCC、MNC及Bottle Neck三种方法,在GSE144520与GSE108214两个数据集进行差异基因分析,最后筛选出了在肺腺癌耐药细胞株中均高表达PGK1基因进行后续的研究;2.PGK1可能通过AKT/m TOR通路改变LUAD患者对化疗的敏感性。(1)通过MTS试验证明了在沉默PGK1后,A549细胞和PC9细胞的存活率下降,化疗敏感性增加;(2)根据PGK1表达情况,将PGK1分成高表达组和低表达组,并进行KEGG通路富集分析。结果显示,PGK1高表达可能与AKT/m TOR通路的激活显著相关。(3)因此我们又通过Western-blot实验,观察到沉默PGK1后p-AKT、p-m TOR蛋白表达水平明显下降。3.PGK1高表达会导致肺腺癌患者化疗疗效下降。在GEO数据库中选取了GSE42127队列进行临床验证,从队列中筛选出接受卡铂联合紫杉醇方案治疗的39名肺腺癌患者进行分析,我们发现,在治疗后死亡患者的组织中PGK1有高表达趋势(P=0.051),在调整年龄、性别、种族等因素后,死亡患者组中PGK1呈高表达(P=0.0286)。并且通过生存曲线我们也得知了,在所有接受化疗患者中PGK1高表达组患者的生存时间较短(P=0.087)Z-IETD-FMK分子量。4.PGK1高表达与肺腺癌患者预后不良相关。(1)我们把在TCGA数据库收集的450例患者分成EGFR突变型和野生型两部分人群,发现PGK1的Buffy Coat Concentrate表达无明显差异(P=0.18);(2)随后又进行单因素和多因素COX回归分析,结果表明PGK1、肿瘤浸润深度和淋巴结转移是肺腺癌患者OS的独立影响因素;(3)用K-M生存曲线分析PGK1高表达和低表达两组间患者预后的差异,其中女性(P=0.028)、年龄≥65(P=0.003)、除白种人外的其他种族(P=0.005)、T2(P=0.049)、M0(P=0.05)在PGK1高表达中与预后较差相关。(4)利用R语言,得出PGK1的表达与肿瘤T分期(P=0.037)、N分期(P=0.026)以及疾病分期(P=0.0095)呈正相关。5.结合PGK1表达与肿瘤分期建立肺腺癌患者预后模型。根据上述结果,建立PGK1表达与肿瘤分期的列线图,结果可知,该预后模型的敏感性和特异性均高于其他临床因素,接近真实世界中肺腺癌患者的生存时间。结论:PGK1通过激活AKT/m TOR通路降低肺腺癌化疗敏感性,且PGK1高表达导致肺腺癌患者化疗疗效不佳及预后不良。通过PGK1表达与肿瘤分期建立了预后模型,可以预测肺腺癌患者的生存时间。

目的 探讨lncRNA SNHG4在乳腺癌中的表达以及调控乳腺癌细胞铁死亡的作用机制。方法 收集2017年1月—2018年12月于我院乳腺外科进行手术治疗的100例乳腺癌患者癌组织及距肿瘤边缘3～5 cm的癌旁组织，应用RT-PCR技术分析SNHG4在乳腺癌组织及配对癌旁组织中的表达。构建SNHG4敲降的乳腺癌MDA-MB-468细胞系及过表达SNHG4的乳腺癌Hs578T细胞系，CCK-8法测定SNHG4对乳腺癌细胞增殖能力的selleck抑制剂影响，应用铁含量测定试剂盒及MDA测定试剂盒检测铁及ROS改变，Western blot实验检测GPX4及EP300蛋白表达，分析EP300与SNHG4及SNHG4与GPX4表达的相关transrectal prostate biopsy性。结果 SNHGNirogacestat分子式4在乳腺癌组织中表达高于癌旁组织(P<0.01),且在侵袭转移能力强的Basal-Like型及ER(-)乳腺癌中高表达(P<0.01),SNHG4高表达与乳腺癌患者的总生存期(OS)及无病生存期(DFS)短相关(P<0.01)。敲降SNHG4导致细胞活力降低(P<0.01),且该作用可被铁死亡抑制剂逆转。机制方面，SNHG4通过上调GPX4表达抑制铁死亡，SNHG4上游可受到组蛋白乙酰基转移酶EP300的正向调控，EP300与SNHG4的表达正相关(P<0.01)。结论 SNHG4在乳腺癌中高表达且可通过EP300-SNHG4-GPX4轴抑制乳腺癌细胞铁死亡。

目的探究祖卡木颗粒对单纯低氧及低氧+Su5416诱导的低氧性肺动脉高压（HPH）小鼠的防治作用及其可能的作用机制。方法利用多种数据库及相关文献搜集祖卡木颗粒中10种单味药的活性成分，预测药物靶点并获得HPH相关靶点，进行网络构建及富集分析。通过单纯低氧及低氧+Su5416诱导建立HPH小鼠AG-221使用方法模型，观察小鼠右心室压力等主要药效学指标，Masson染色观察肺组织病理变化，WesternBloDinaciclibt检测肺组织中bax、bcl-2、PI3K、p-PI3K、eNOS、HIF-1α蛋白表达水平。结果筛选得到祖卡木颗粒共167种活性成分，与HPH有179个交集靶点，涉及PIK3CA、HIF1等靶点。验证结果显示，祖卡木颗粒可以显著降低HPUniversal Immunization ProgramH小鼠的右心室压力，减轻右心室肥厚，下调小鼠肺组织中bcl-2、HIF-1α蛋白的表达，上调bax、PI3K、p-PI3K、eNOS蛋白的表达。结论祖卡木颗粒可能通过调节bax/bcl及PI3K-eNOS/HIF-1α信号通路对HPH起到防治作用。