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糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种以胰岛素绝对或相对缺乏、并由此导致的高血糖为特征的代谢性疾病,其发病率在全球范围内逐年快速增长。1型糖尿病(Type 1 diabetes melitus,T1DM)和2型糖尿病(Type 2 diabetes melitus,T2DM)是糖尿病的主要分型,且均为肾脏疾病的独立危险因素。研究表明,即使接受常规降糖治疗,依然有30%以上的糖尿病患者并发慢性肾脏损伤。因此,开发具有降糖并缓解肾脏损伤的药物对于糖尿病肾脏并发症的预防与治疗具有重要意义。人参(Panax Ginseng C.A.Mey)是治疗糖尿病的经典中药之一。近年来研究表明,人参及其药效成分具有显著调节糖尿病大鼠血糖与胰岛功能的作用,但其防治糖尿病肾脏损伤的药效作用及其作用机制,尚缺乏系统整体性研究。代谢组学和转录组学系统生物学中主要研究方法,能够对机体应对外界刺激下内源性小分子代谢物和基因表达整体变化进行系统分析,目前已成为揭示中药药效阐释的有力手段。因此,本研究整合基于液质联用技术的代谢组学方法与有参转录测序(RNA-seq)的肾脏组织转录组学研究方法,从代谢和基因层面对人参水提物防治T1DM和T2DM大鼠肾脏损伤的作用机制进行深入研究,探索和阐明人参防治糖尿病肾脏损伤的科学内涵。主要研究内容包括以下几个方面:1.人参水提物防治糖尿病大鼠肾脏损伤的药效学与代谢组学研究本研究中,采用药效学结合代谢组学方法考察人参水提物对糖尿病大鼠肾脏损伤的药效作用与代谢调控机制。分别建立HFD联合低剂量STZ诱导的T2DM大鼠模型和高剂量STZ诱导的T1DM大鼠模型,给予人参水提物治疗四周,考察人参水提物对糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱、胰岛功能和肾脏功能的影响。结果表明,人参水提物可显著缓解两种糖尿病模型大鼠高血糖和脂质紊乱,并能够购买GW4869明显降低糖尿病大鼠血清尿素氮和肌酐含量,延缓肾脏病理形态的改变。而后,本研究采集人参水提物治疗糖尿病大鼠四周后血清和尿液样本,利用UPLC-QTOF/MS方法结合多元统计和生物信息学等方法分析血清和尿液代谢轮廓,鉴定并分析人参水提物治疗糖尿病大鼠的代谢标志物和及其生物学意义。结果显示,人参水提物可显著改善T2DM和T1DM所致大鼠血清和尿液代谢轮廓的改变,共获得人参水提物治疗T2DM大鼠的25种血清和23种尿液代谢物标志物,主要包括苯丙氨酸、组氨酸、柠檬酸和尿嘧啶等,分布于色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、嘌呤和嘧啶等代谢途径;而人参水提物调控T1DM大鼠的代谢标志物30种(血清16种、尿液14种),则包括乳酸、甲酚硫酸盐、异柠檬酸、丙酮酸和乙酸等,涉及氨基酸(苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、色氨酸代谢)和能量代谢(TCA循环、丙酮酸循环、糖酵解/糖异生)等代谢途径的调节作用。人参水提物对T2DM大鼠氨基酸代谢轮廓调节作用较T1DM的作用更为显著,而人参水提物对T1DM大鼠能量代谢的调节作用较好,主要通过抑制T1DM大鼠丙酮酸代谢,而促进下游糖酵解和TCA循环、增加机体对葡萄糖的代谢,从而发挥能量代谢调控作用。氨基酸代谢(苯丙氨酸代谢通路、色氨酸代谢等)、糖代谢(TCA循环和糖酵解/糖异生)、和亚油酸代谢是人参水提物调节两类糖尿病大鼠模型的共同代谢途径,且与肠道菌群失调、肾功能障碍和能量代谢失衡等糖尿病和糖尿病肾病进展的驱动因素密切相关。由此可见,人参水提物可能通过调节氨基酸代谢紊乱、维持能量代谢稳态和调控肠道菌群结构相关的代谢过程,在糖尿病疾病发挥延缓糖尿病肾脏损伤进程的药效作用。2.人参水提物防治糖尿病大鼠肾脏损伤的肾脏转录组学研究本研究采用基于RNA-seq的转录组学方法测定人参水提物对T1DM和T2DM大鼠肾脏基因表达的影响,整合代谢组学关联分析,探究人参水提物防治糖尿病大鼠肾脏损伤的作用机制。首先,转录组学测定结果表明,人参水提物可显著回调T2DM和T1DM引起的大鼠肾脏基因轮廓变化,结合生物信息学分析,共获得人参水提物调节的T2DM大鼠肾脏差异基因1634个,涉及细胞表面受体信号通路、跨膜转运蛋白活性、PPAR信号通路、苯丙氨酸代谢、柠檬酸代谢、糖酵解/糖异生等途径,其中关键差异基包括Ppara、Pck1、Fbp2、G6pc、Hk2等;而人参干预T1DM肾脏的差异基因数量为325个。其次,转录组学整合代谢组学关联分析,人参水提物可显著调节T2DM大鼠PPAR信号通路、氨基酸代谢和能量代谢途径中关键基因和代谢标志物的产生,发挥肾脏保护作用;而人参水提物主要参与T1DM肾脏氨基酸和脂质代谢的调节。利用RT-q PCR方法进一步验证其对T1DM肾脏代谢相关差异基因(B3galt2、Mogat2和Pipox)和炎症反应相关差异基因(Ilb、Il21r、Clec7a和Cd84)等m RNA表达具有显著回调作用。在基础上,综合转录组学结果发现,人参水提物对T2DM和T1DM共同调控的差异基因共有68个,主要包括TlrBaricitinib体内实验剂量7、Hk2、Clec5a和Mogat2等,共同调控的核心通路为TLR信号通路、NF-κB信号通路和趋化因子信号通路等驱动DN进展的炎症反应过程密切相关联,表明改善糖尿病大鼠肾脏炎症反应,可能是人参防治糖尿病鼠肾脏损伤进程。综上,本部分从基因水平阐明人参水提物防治糖尿病大鼠肾脏损伤的作用机制,初步明确可能TLR和NF-κB等炎症信号通路可能是人参水提物干预T1DM和T2DM肾脏损伤的共同关键机制。3.人参防治糖尿病肾脏损伤的网络药理学分析采用网络药理学方法,探究人参水提物干预糖尿病肾脏损伤进展的潜在药效成分与作用靶点。首先,基于网络药理学数据库筛选人参潜在活性成分及其靶点,共获得人参活性成分66个,成分相关靶点132个。生物信息学功能富集分析结果显示,人参成分靶点主要为膜蛋白复合物和转运复合体构成蛋白,并参与细胞间信号转导的正调控、炎症因子应答等生物过程Invertebrate immunity,与TLR信号通路、NOD样受体信号和胰岛素信号等KEGG通路相关联。其次,整合网络药理学与转录组学结果,分析发现人参水提物防治肾病损伤的差异基因和人参活性成分靶点信息,发现其共同富集于TLR信号通路和趋化因子信号通路等与炎症反应相关通路。在此基础上,利用分子对接方法,验证网络药理学分析中11种活性成分与TLRs、IL1B、TNF、PTGS2、IKBKB、JUN、PPARG和GSK3B等关键靶点间的相互作用。结果显示,人参活性成分Panaxadiol、Ginsenoside-Rh4和Frutinone A可与TLRs形成稳定构象,可能抑制其蛋白表达与活性,进而阻抑TLR/NF-κB信号通路的活化。综上,转录组学与网络药理学分析相关联,进一步明确人参及其活性成分能够通过TLRs/NF-κB通路介导的炎症反应,改善糖尿病肾脏损伤中炎症环境,发挥防治糖尿病肾脏损伤的作用机制。4.人参水提物对糖尿病肾脏损伤中TLR4/NF-κB/NLRP3通路调控作用的研究基于代谢组学、转录组学和网络药理学的结果,本部分采用western blot等分子生物学方法,验证人参水提物对两种糖尿病大鼠模型肾脏中TLR家族中关键差异基因和TLR4/NF-κB/NLRP3炎症通路的调控作用。结果证明,人参水提物可显著回调T1DM和T2DM引起的大鼠肾脏组织中TLR2、TLR4、TLR7和TLR9蛋白和m RNA的表达变化,并调节NLRP3炎性小体相关蛋白和m RNA表达,抑制炎性因子释放。同时,为进一步验证人参水提物对肾脏炎症反应的调节作用,本研究以巨噬细胞细胞系RAW264.7为研究对象,采用高糖条件处理巨噬细胞模拟体内糖尿病环境,考察不同浓度人参水提物对巨噬细胞增殖、活化及TLR4/NFκB/NLRP3通路的调节作用。结果表明,人参水提物对低糖条件和高糖条件下巨噬细胞活力无明显影响;而低浓度和高浓度的人参水提物均可显著抑制TLR4蛋白表达,与高糖引起的巨噬细胞NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3和ASC的过表达,阻抑NLRP3炎性小体活化,进而减少巨噬细胞中NLRP3炎性小体产物IL-18和IL-1β的分泌。本部分研究,利用体内糖尿病动物模型和高糖诱导的体外巨噬细胞模型,确证人参水提物能够抑制糖尿病肾脏中TLR4/NF-κB/NLRP3通路的活化,缓解糖尿病引发的肾脏炎症反应,进而防治糖尿病肾病损伤进展的作用机制。综上所述,本研究以人参水提物为研究对象,利用传统药理学评价方法,明确人参水提物对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用;整合代谢组学、转录组学与网络药理学分析方法,从代谢-基因-活性成分多层面出发,系统揭示人参水提物防治糖尿病大鼠肾脏损伤的分子机制;同时,利用体内糖尿病动物模型和体外高糖诱导的巨噬细胞模型,阐明人参水提物通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路介导的炎症反应,防治糖尿病肾脏损伤进展的作用机制。本研究结合先进的分析技术手段,探讨中药的作用机制,为阐明人参水提物防治糖尿病肾脏损伤的作用机制提供理论依据,同时也为中药作用机制的系统研究提供了新的方法路线。

目的 探讨FN1基因变异所致纤维连接蛋白沉积肾小球疾病2型（GFND2）的临床表型及遗传学特征。方法 回顾分析2023年3月于中山市小榄人民医院儿科收治的1例以眼睑浮肿为主诉的GFND2患儿为研究对象medical ethics。采集该患儿的临床数据资料，采用全医学外显子组测序（WES）对患儿及其父母行遗传学分析，并回DNA Damage/DNA Repair抑制剂顾国内外文献报道的FN1基因突变所致GFND2病例的临床特点以及遗传学特征。总结已报道FN1所致GFND2基因变异和临床特点的关系。结果 患儿，男，8岁，以眼睑浮肿、血尿、蛋白尿、高血压为临床特点。全医学外显子测序结果提示其携带FN1基因c.938G>T位点杂合基因变异，现国内尚未见以该位点变异的报道。连同16篇文献报道的50例FN1基因变异致病患者，主要临床表现为高血压（14/50,28%）、血尿（20/50,40%）、蛋白尿（31/50,62%）。共检出FN1基因变异1CFTR抑制剂6个。结论FN1基因c.938G>T(p.Gly313Val)是本例患儿的致病原因。本研究丰富了FN1相关的GFND2基因变异谱，并为临床诊断、产前诊断提供了依据。对于高血压、蛋白尿、血尿的患儿，需尽早完善基因检查明确病因。

目的 评价吗啉硝唑注射液在胆囊结石伴急性胆囊炎患者围手术期应用中的临床疗效及安全性。方法 选取202Fish immunity1年6～9月于医院行腹腔镜胆囊切除术治疗的胆囊结石伴急性胆囊炎患者60例为研究对象，按随机数字表法分为观察组和对照组，每组30例。围手术期对照组仅给予头孢唑林钠抗感染治疗，观察组在对照组的基础上联合吗啉硝唑治疗。比较2组药物抗感染效果、治愈时间，并观E-616452配制察2组不良反应发生情况。结果 治疗后观察组术Pidnarulex后第1天体温、术后第3天白细胞计数、术后第3天降钙素原均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);2组患者治愈时间和并发症发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 急性胆囊炎患者围手术期给予头孢菌素联合吗啉硝唑治疗可有效控制感染、减轻机体炎性反应，具有良好的安全性，值得临床推广应用。

目的：观察降糖补肾汤治疗糖尿病肾病的临床疗效及对患者肾损伤的影响。方法：选择84例糖尿病肾病患者，按随机数字表法分为对照组和治疗组各42例。对照组给予还原型谷胱甘肽静脉滴注，治疗组在对照组基础上给予降糖补肾汤治疗，连续治疗60 d。比较2组治疗前后肾功能指标[α1-微球蛋白（α1-MG）、尿白蛋白排泄率（UAER）、24 h尿蛋白定量、血肌酐（SCr）、尿β2-微球蛋白（β2-MG）]，糖脂代谢指标[餐后2 h血糖（P2hBG）、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）]，血脂指标[总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）]，血清肾损伤指标[骨形成蛋白-7 (BMP-7)、转化生长因EPZ-6438试剂子-β1 (TGF-β1)、肾损伤分子-1 (KIM-1)、血清胱抑素C (CysC)]水平，并比较2组临床疗效。结果：治疗组治疗总有效率90.48%，高于对照组69.05%(P<0.05)。治疗后，2组肾小球滤过率升高（P<0.05），且治疗组高于对照组（P<0.05）;2组尿α1-MG、UAER、24 h尿蛋白定量、SCr、尿β2-MG下降（P<0.05），且治疗组低于对照组（P<0.05）。治疗后，2组P2hBG、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C水平均下降（P<0.05），且治疗组低于对照组（P<0.05）。治疗后，2组血清BMP-7水平升高（P<0.05），且治疗组高于对照组（P<0.05）,2组血清TGF-β1、CysC、KIM-1水平均下降（P<0.05），且治疗组低于对照组（P<0.05）。结论：降糖补肾汤治疗糖尿病肾病能够提高临床疗效，改善患者肾功能指标和糖脂代谢指genetic accommodation标，减轻肾Decitabine供应商损伤。

目的 采用网络药理学和分子对接的方法分析苦参抗乳腺癌的主要活性成分及潜在分子机制。方法 采用TCMSP、ETCM数据库和查阅国内外文献收集筛选苦参化学成分，通过Swiss Target Prediction数据库对有效活性成分的靶点进行预测，通过GeneCards、T点击此处TD、Drugbank、OMIM收集乳腺癌相关靶点，根据Venny 2.1.0软件筛选出苦参抗乳腺癌疾病靶点；采用Cytoscape软件构建苦参-核心活性成分-靶点网络图，用STRING数据库分析共有靶点，构建PPI网络图，通过DAVID数据库和Hiplot平台对关键靶点蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并采用SchrodingerBiocontrol fungi软件对活性成分与靶点进行分子对接，同时采用分子生物学方法对关键靶点进行验证。结果 从苦参中共筛选出结构明确的活性成分36个，筛选出70个苦参抗乳腺癌的疾病靶点，其中EGFR、AKT1、ESR1、SRC、CYP19A1、AR、ABCB1等12个核心靶点参与乳腺癌中内分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、雌激素等信号通路，且核心成分与关键靶点AR之间的结合能最高。体外细胞实验显示，苦参提取物可抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，上调AR蛋白的表达。结Naporafenib论 苦参通过多成分作用于多靶点和多个信号通路，调节复杂的生物过程发挥抗乳腺癌的作用，苦参对AR蛋白的上调可能成为治疗乳腺癌新的治疗策略。

肠屏障由机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障共同组成，在维持肠腔内环境稳态和肠上皮结构完整性等方面发挥重要作用.首先建构小鼠慢性束缚应激模型并进行血浆激素水平检测和小鼠旷场实验，验证模型是否建构成功.随后通过常规组织学染色、免疫组化、 TUNEL免疫荧光、 ELISA等方法研究慢性束缚应激对小鼠小肠的损伤作用.结果显示，慢性束缚应激显著提高小鼠血浆NE和CORT水平(p<0.05),降低小鼠小肠绒毛高度(V,p<0.05)、增加隐窝深度(C,p<0.05),降低V/C比值(p<0.05)及紧密连接蛋白ZO-1表达量(p<0.01);显著减少小肠杯状细胞和内皮单核淋巴细胞数量(pStaurosporine纯度<0.01),提示慢性束缚应激造成了小鼠肠道损伤和免疫功能抑制.进一步研究发现，慢性应激小鼠肠道内PCNA阳性bio-based economy表达显著减少(p<0.01)、凋亡细胞显著增多(p<0.01);血浆GDC-0973抑制剂中TNF-α,IL-1β,IL-18含量显著升高(p<0.01),而IL-10显著降低(p<0.01).血浆氧化-抗氧化指标结果显示，慢性束缚应激显著增加小鼠血浆MDA含量(p<0.05),降低T-AOC,SOD,CAT,GSH-Px(p<0.05)活性，提示慢性束缚应激诱导机体氧化应激.该研究表明慢性束缚应激通过引发机体氧化应激，造成肠上皮细胞更新抑制和肠道屏障结构损伤，加重机体炎症反应.

目的 分析高脂血症患者中医体质类型及通心络胶囊对痰湿体质者血脂、氧化应激的影响。方法 收集2021年8月至2022年8月景县中医院收治的高脂血症患者200例为研究对象，评价患者中医体质the oncology genome atlas project类型。选取痰湿体质高脂血症患者并采用随机数字表法将其分为痰湿体质对照组和痰湿体质试验组。痰湿体质对照组患者给予阿托伐他汀钙片口服，痰湿体质试验组患者在痰湿体质对照组基础上加用通心络胶囊口服，疗程均为4周。比较平和体质与痰湿Tamoxifen抑制剂体质高脂血症患者一般资料（性别、年龄、BMI）、血脂指标（TC、TG、LDL-C、HDL-C水平）及氧化应激指标[丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性]，比较痰湿体质对照组和痰湿体质试验组治疗前后血脂指标及氧化应激指标。结果 200例高脂血症患者中，痰湿体质55例（27.5%）（痰湿体质对照组27例，痰湿体质试验组28例），气虚体质40例（20.0%），血瘀体质34例（17.0%），阳虚体质19例（9.5%），阴虚体质17例（8.5%），湿热体质13例（6.5%），平和体质10例（5.0%），气郁体质8例（4.0%），特禀体质4例（2.0%）。痰湿体质高脂血症患者TC、TG、LDL-C、HDL-C水平selleck HPLC高于平和体质高脂血症患者，SOD活性低于平和体质高脂血症患者（P<0.05）。治疗后，痰湿体质试验组TC、TG、LDL-C水平低于痰湿体质对照组，HDL-C水平高于痰湿体质对照组（P<0.05）。治疗后，痰湿体质试验组MDA含量低于痰湿体质对照组，SOD、GSH-Px、CAT活性高于痰湿体质对照组（P<0.05）。结论 痰湿体质是高脂血症患者的主要中医体质类型，通心络胶囊可改善痰湿体质高脂血症患者的血脂及减轻其氧化应激。

湿热证是中医临床常见证型，而湿热也是许多难治性疾病的重要病机，且其患病占比率逐年增加。三仁汤是开上、畅中、渗下的经典方剂，具有宣畅气机、清热利湿的功效，主要症状Automated DNA包括头痛恶寒， 身重疼痛， 面色淡黄， 胸闷Empagliflozin分子式不饥等。现代临床将其广泛应用于呼吸、心血管、消化、泌尿等系统疾病，并取得了显著的效果。三仁汤能够明显改善湿热证患者的临床症状，提高生活质量，尤其对一些难治性疾病，可以延缓病情发展，延长生存期。目前基于湿热证的三仁汤作用机制主要包括抗炎、调节免疫功能，调节水通道蛋白表Staurosporine抑制剂达，调节神经内分泌功能，调节胃肠激素水平和胃粘膜蛋白差异表达，改善糖脂代谢及能量代谢紊乱等。笔者对近年来基于湿热证的三仁汤在临床疗效和实验研究进行整合与梳理，阐述了三仁汤的理论基础、临床与机制研究，为扩展三仁汤的现代临床应用提供理论依据和参考。

目的 总结上消化道受累的儿童嗜酸性粒细胞性胃肠道疾病（eosinophilic gastrointestinal diseases,EGIDs）的胃镜表现，为儿童EGIDs的诊断提供经验。方法 收集并分析2016-01-01—2diABZI STING agonist022-12-31首都医科大学附属北京儿童医院消化科就诊的上消化道受累的EGIDs患儿初次诊断时胃镜检查结果。结果 共纳入121例上消化道受累的EGIDs患儿（男89例、女32例），食管受累者31例（25.62%），胃部受累者39例（32.23%），十二指肠受累者85例（70.25%）。食管确认细节受累者中常见的异常为Advanced medical care黏膜粗糙（32.26%）、充血水肿（25.81%）、环状改变（9.68%）、糜烂（9.68%）、黏膜红斑（9.68%），胃镜下无异常的占45.16%。胃部受累者可见胃黏膜充血水肿（100%）、胃黏膜花斑样（71.79%）、黏膜红斑（25.64%）、胃底黏液池浑浊或胆染（23.08%）、出血斑或咖啡斑（20.51%）、糜烂（15.38%）、黏膜粗糙（15.38%）及溃疡（12.82%）。十二指肠受累者常见异常为黏膜充血水肿（58.82%）、溃疡（31.76%）、白苔（23.53%）、红斑（22.35%）、粗糙（22.35%）、糜烂（15.29%）等，胃镜下未见异常的为28.24%。十二指肠受累者溃疡发生率高于胃部受累者（χ~2=5.011,P<0.05），而出血样改变更常见于胃部（χ~2=5.940,P<0.05）。结论 儿童EGIDs胃镜表现缺乏特异性。食管受累者可见黏膜粗糙、充血水肿、环状改变等；胃部受累者可见黏膜充血水肿、花斑样、黏膜红斑等，而十二指肠受累常见异常为黏膜充血水肿、溃疡、白苔、黏膜红斑等。约半数食管受累和1/4十二指肠受累的EGIDs患儿胃镜下表现无异常。

研究目的通过生物信息学和网络药理学虚拟筛选四逆加人参汤(SNRS)治疗急性肝衰竭(ALF)的众多靶点中与糖酵解相关的关键靶基因和关键通路,并对关键靶基因进行免疫浸润分析,为SNRS通过影响糖代谢重编程调控巨噬细胞极化状态发挥治疗效应提供理论基础,并为后续实验设计提供参考思路;进一步通过腹腔注射LPS/D-Gal N构建小鼠ALF模型,开展SNRS治疗ALF的药效学研究,并观察SNRS对肝巨噬细胞亚型浸润情况的影响,验证SNRS治疗ALF的有效性及其对肝巨噬细胞极化状态的调控作用;最后制备并筛选最佳浓度SNRS含药血清,与LPS共处理小鼠RAW264.7巨噬细胞,并基于m TOR/HIF-1α通路探讨SNRS含药血清对LPS诱导活化的巨噬细胞的能量代谢方式及极化状态的影响。为SNRS通过干预免疫代谢重塑巨噬细胞极化状态以治疗ALF提供科学依据。研究方法第一部分四逆加人参汤调控糖酵解治疗ALF潜在靶基因的免疫浸润分析通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)平台下的基因表达综合数据库(GEO)收集乙肝相关性急性肝衰竭(HBV-ALF)、对乙酰氨基酚相关性急性肝衰竭(APAP-ALF)的人体肝组织芯片数据,并对二者各自所表达的差异基因进行筛选;随后,与糖酵解相关基因、SNRS效应靶基因进行取交集处理,从而获得SNRS通过作用于糖酵解干预ALF的潜在靶基因,并对其进行基因功能注释;最后,对比分析ALF和正常肝组织中免疫细胞浸润情况,并将最终获取的靶基因表达水平与ALF肝组织免疫细胞浸润程度进行相关性分析。第二部分四逆加人参汤对LPS/D-Gal N诱导的急性肝衰竭模型的药效学研究采用随机数字表法,将63只ICR小鼠随机分成空白组、模型组、中药组,每组各21只。模型组与中药组均单次腹腔注射D-Gal N(800mg/Kg)+LPS(20μg/Kg),而空白组予以单次腹腔注射等量生理盐水。中药组小鼠分别于造模前48h、24h以及造模后10min予以“四逆加人参汤”灌胃处理,而空白组和模型组于相同时间点予以生理盐水灌胃处理。于注射造模剂后8h,每组随意取6只用于样本取材及标本检测,每组余下的15只小鼠进行生存率分析。实验过程中,观察并记录造模后各组小鼠的精神状态、毛发状况、饮食及二便情况。利用全自动生化分析仪检测小鼠血清ALT、AST;采用ELISA测定TNF-α、HMGB-1、IL-1β、IL-6及IL-10;对肝组织切片进行HE染色,观察肝组织病理学变化;采用免疫荧光染色观察肝组织中M1型、M2型巨噬细胞浸润情况。第三部分四逆加人参汤重塑巨噬细胞极化状态体外实验研究实验一四逆加人参汤含药血清制备及浓度筛选采用随机数字表法将20只SD大鼠分为SNRS组和空白组,每组10只。SNRS组灌服中药,空白组灌服等体积生理盐水。每日给药2次,连续给药3d,末次给药1h后采血。采血后对大鼠全血进行离心、灭活、除菌,制得SNRS含药血清。取对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中,加入LPS100ng/ml以诱导RAW264.7细胞向M1型极化。采用CCK8法检测不同浓度的空白血清、含药血清对正常培养的RAW264.7细胞及LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响,并根据结果设置高、中、低三个血清浓度,用于后续最佳浓度筛选。采用高、中、低浓度含药血清处理LPS诱导活化的RAW264.7细胞24h后,采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α浓度,比色法检测LD释放量,Western Blot法检测m TOR、p-m TOR及HIF-1α的表达水平。实验二四逆加人参汤调控m TOR/HIF-1α信号通路影响糖代谢重编程重塑巨噬细胞极化状态取对数生长期的RAW264.7细胞,接种于96孔板中。利用CCK8法检测MHY1485、Rapamycin对未经LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响;检测10%含药血清、10%含药血清+MHY1485、Rapamycin对LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响。取对数生长期的RAW264.7细胞,Gefitinib核磁接种于6孔板中,共设置5个实验分组:(1)空白组;(2)模型组;(3)LPS+含药血清组;(4)LPS+含药血清+m TOR激动剂组;(5)LPS+空白血清+m TOR抑制剂组。药物处理24h后,利用光镜观察细胞形态;流式细胞仪检测分析M1(CD86+CD206)、M2(CD86-CD206+)细胞亚群的比例;WB检测细胞m TOR、p-m TOR及HIF-1α的表达;ELISA检测细胞上清IL-1β、TNF-α及IL-10水平,ELISA检测细胞提取液中HK2、PFK-1、PKM2及LDHA浓度;比色法检测细胞上清LD含量,比色法检测细胞提取液中Ac-Co A、ATP水平。此外,使用透射电镜观察空白组、模型组及LPS+含药血清组细胞超微结构。研究结果第一部分四逆加人参汤调控糖酵解治疗ALF潜在靶基因的免疫浸润分析本研究收集了2个HBV-ALF的表达谱芯片数据集(GSE38941、GSE14668)和1个APAP-ALF的表达谱芯片数据集(GSE120652)。利用韦恩图在线工具将APAPALF差异表达基因集、合并的HBV-ALF差异表达基因集、糖酵解基因集以及SNRS作用靶基因集进行取交集处理;筛选出SNRS调控糖酵解治疗HBV-ALF的作用靶基因共有5个,分别为己糖激酶2(HK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(GOT1);APAP-ALF并未获得类似基因。HBV-ALF组相较于正常组,HK2、CDK1表达上调,而SOD1、VEGFA和GOT1表达下调。对5个作用靶基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,GO分析结果显示生物过程(BP)主要涉及“对铜离子的响应”、“细胞衰老”、“对镉离子的响应”、“对轴突损伤的反应”、“卵泡发育”等;细胞成分(CC)主要富集在线粒体。KEGG富集通路主要集中在缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、碳代谢等。免疫浸润差异分析提示HBV-ALF肝组织中免疫细胞浸润水平较正常肝组织明显增加。HBV-ALF肝组织中浸润的免疫细胞主要包括树突状细胞、中性粒细胞、M2型巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M0型巨噬细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和B细胞等。对5个作用基因与HBV-ALF肝组织中浸润的主要免疫细胞进行相关性分析,结果提示SNRS可以通过作用靶基因影响免疫细胞浸润。第二部分四逆加人参汤对LPS/D-Gal N诱导的急性肝衰竭模型的药效学研究经腹腔注射D-Gal N(800mg/Kg)+LPS(20μg/Kg)诱导构建的ICR小鼠ALF模型,一般情况差,24h死亡率达80%。与空白组相比,ALT、AST水平明显升高;TNF-α、HMGB-1、IL-1β和IL-6的释放明显增加;肝组织病理学损伤严重;肝组织中M1型巨ABT-199化学结构噬细胞标志物CD86表达明显增加,M2型巨噬细胞标志物CD163表达相对增加。经SNRS处理的ALF小鼠,一般情况改善,24h死亡率为26.7%。与模型组相比,ALT、AST水平明显降低;TNF-α、HMGB-1及IL-1β释放明显减少,IL-6水平呈下anti-tumor immunity降趋势,而IL-10表达水平明显增加;肝组织病理学损伤减轻;肝组织中M1型巨噬细胞标志物CD86表达明显减少,M2型巨噬细胞标志物CD163表达明显增加。第三部分四逆加人参汤重塑巨噬细胞极化状态体外实验研究实验一四逆加人参汤含药血清制备及浓度筛选相同稀释浓度下的空白血清与含药血清对正常培养的RAW264.7细胞进行处理,两组细胞活力的组间差异无统计学意义。各稀释浓度(2.5%、5%、10%、15%及20%)的含药血清处理LPS诱导活化的RAW264.7细胞,均可以降低细胞增殖活力。15%、20%浓度的空白血清可以降低LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力。选择2.5%、5%、10%的梯度浓度用于后续最佳含药血清浓度的筛选。SNRS含药血清呈剂量依赖性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎症因子IL-1β、TNF-α,并减少了糖酵解代谢产物LD的生成。LPS诱导状态下的RAW264.7巨噬细胞m TOR/HIF-1α通路相关蛋白表达明显增加,而SNRS含药血清呈剂量依赖性降低p-m TOR/m TOR比值及HIF-1α蛋白相对表达量。实验二四逆加人参汤调控m TOR/HIF-1α信号通路影响糖代谢重编程重塑巨噬细胞极化状态MHY1485、Rapamycin对RAW264.7细胞增殖活力无明显影响。电镜结果显示模型组相较于空白组,细胞线粒体出现了严重肿胀,而SNRS含药血清可以有效改善线粒体肿胀程度。光镜及流式细胞仪结果提示,LPS诱导RAW264.7细胞活化后,M1型、M2型巨噬细胞增多;与模型组相比,含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞后,M1极化细胞减少,M2极化细胞增多;而在含药血清基础上加用MHY1485,可以逆转含药血清对M1型、M2型极化分布的影响。模型组IL-1β、TNF-α表达水平明显增加,IL-10具有增高趋势;含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,可以抑制IL-1β、TNF-α表达,并显著升高IL-10水平;而MHY1485可以逆转含药血清的抗炎效应。模型组p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量显著升高;使用含药血清、Rapamycin对LPS诱导活化的RAW264.7细胞进行干预后,p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量明显降低;而在含药血清基础上加用MHY1485,可以逆转含药血清降低p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量的作用。模型组HK2、PFK1、LDHA表达水平明显升高,细胞上清中LD含量显著增加;使用含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,可使HK2、PFK1、LDHA表达水平明显下降,细胞上清中LD含量显著减少;而MHY1485可以逆转含药血清的调控效应。与空白组比较,模型组RAW264.7细胞中Ac-Co A、ATP含量明显减少;与模型组相比,使用含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,Ac-Co A、ATP含量显著增加;而在含药血清基础上加用MHY1485,AcCo A、ATP含量比单用含药血清明显降低。结论SNRS可以改善ALF小鼠一般状况,提高生存率,降低转氨酶水平,调控炎症介质释放,改善病理学组织损伤,影响肝巨噬细胞亚型浸润分布。肝巨噬细胞作为肝脏固有免疫系统的重要组成部分,参与了ALF发病过程中的免疫损伤。SNRS可以通过调控m TOR/HIF-1α信号通路,抑制HK2、PFK1、LDHA表达,减少LD分泌,增加Ac-Co A生成,促进ATP合成,改善免疫代谢;抑制M1型巨噬细胞激活,促进M2型巨噬细胞活化,重塑巨噬细胞极化状态;降低促炎因子IL-1β、TNF-α表达,增加抗炎因子IL-10分泌,积极发挥抗炎、促修复作用。此外,SNRS还可以保护RAW264.7细胞线粒体结构,维持其线粒体功能。