目的酒精性肝损伤(ALI)是由长期过量饮酒所导致的肝脏损伤。慢性酒精消耗会引起肝脏氧化应激、活性氧(ROS)的产生、不稳MLN4924定铁积累、线粒体损伤、内质网应激(ERS)等一系列病理变化。ASIC1a是可被细胞外酸性物质激活的pH感受器,活化时介导钙离子的内流引发ERS。持续的ERS会引发PERK、IRE1、ATF6三条通路的激活,引发铁死亡和自噬。铁死亡是自噬依赖性的细胞死亡,细胞内铁蛋白的降解导致铁超载和ROS积累,介导PERK-eIF2α-ATF6的激活。在ALI中,酒精会诱导肝脏发生ERS和铁死亡,也会引起肝脏缺氧和糖酵解激活,因此可能会存在ASIC1a的高表达,但铁自噬与ALI的研究尚未报告。因此我们将研究ASIC1a与ERS、铁自噬在ALI小鼠肝脏中的表达和可能的作用机制。方法本课题采用Western blot、免疫组化、qRT-PCR技术观察ASIC1a在小鼠体内外的表达。体内实验,采用高斌法建立ALI小鼠模型,将C56BL/6小鼠随机分为四组,对照饮食组(CD-fed)、酒精饮食组(EtOH-fed)、酒精饮食加重组腺相关病毒空载体对照组(EtOH-fed+rAAV8-Vector)、酒精饮食加重组腺相关病毒ASIC1a敲低组(EtOH-fed+rAAV8-shASIC1a)。收集小鼠血清和肝脏,从血清学、病理、蛋白和mRNA等方面探究ASIC1a、PERK-elF2α-ATF4通路和铁自噬在ALI在的作用和可能机制。体外实验,使用200m M浓度酒精刺激小鼠肝细胞AML12细胞9小时建立体外模型。采用ASIC1a特异性阻断剂和小RNA技术阻断或敲低AML12细胞中ASIC1a的表达,HE染色、油红O染色、Western blot、免疫组化、qRT-PCR技术观察ALI的组织病理学变化和脂质沉积、内质网应激PERK-elF2α-ATF4通路和铁自噬相关蛋白的表达。体外给予AML12细胞ATF4 si RNA和PERK特异性抑制剂ISRIB抑制内质网应激PERK-elF2α-ATF4通路,运用Western blot、免疫荧光、qRT-PCR、电镜技术和油红O染色检测铁自噬的表达变化和脂质沉积。结果小鼠体内实验,酒精引起肝脏损伤和脂肪变性,同时伴随ASIC1a和铁死亡标志物ACSL4、铁自噬指标、内质网应激通路PERK-eIF2α-ATF4表达的激活。体外实验,ASIC1a和铁自噬指标在酒精诱导的AML12细胞中表达升高,与铁死亡诱导剂erastin处理结果一致。HE染色、油红O染色结果显示,体内沉默ASICa改善了酒精诱导的肝脏损伤和脂肪变性。免疫组化、Western blot、qRT-PCR结果显示沉默ASIC1a可以降低酒精诱导的铁死亡、铁自噬和ERS。Western blot、qRTPCR、免疫荧光和油红O染色结果显示,敲低AML12细胞中的ASIC1a可以降低酒精诱导的PERK-eIF2α-ATF4通路和铁自噬,改善肝细胞脂质堆积。Western blot、电镜、免疫荧光和油红O染色结果显示,PcTX-1阻断AML12细胞中的ASIC1a可以降低酒精off-label medications诱导的PERK-eIF2α-ATF4通路、铁自噬、GSH耗竭、MDA蓄积和自噬溶酶体的数量,改善肝细胞脂质堆积、线粒体肿胀破坏和自噬囊泡的形成。此外,通过敲低AML12细胞中的ATF4可以降低内质网应激和脂肪变性。最后,使用ISRIB特异性阻断AML12细胞中的ASIC1aRegorafenib供应商可以减轻酒精诱导的铁自噬、氧化损伤和脂肪变性。结论我们发现ASIC1a在ALI小鼠和酒精诱导的AML12细胞中表达升高。在体内和体外实验中,ASIC1a的沉默减弱了ALI中的炎症和脂质积累,降低了内质网应激中PERK/elF2α/ATF4的表达水平以及铁自噬水平。此外,我们发现,抑制PERK/elF2α/ATF4轴和敲低ATF4可以抑制铁自噬,减轻线粒体损伤和脂质积累。总之,我们的实验结果表明,ASIC1a促进铁自噬是ALI发病的一个重要过程。PERK/elF2α/ATF4-铁自噬是一种新的调节机制,可能是ALI治疗的潜在靶点。