视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disease,NMO-SD)是一种罕见的自身免疫介导的主要累及视神经和脊髓的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,因其特异性致病抗体水通道蛋白4免疫球蛋白G(aqua-porin-4 immunoglobulin G,AQP4-IgG)靶向星形胶质细胞足突上的AQP4,继发星形胶质细胞损伤,也被称为星形胶质细胞病。临床上好发于青壮年女性,具有高复发、高致残的特点。研究表明血脑屏障(blood brain barrier,BBB)破坏及免疫炎症激活在NMOSD发病机制中起关键作用,并且直接影响NMOSD患者的临床严重程度及预后。反复复发累积的神经功能残疾严重影响着患者的生活质量。目前治疗NMOSD的药物选择有限,且相当一部分患者对药物反应疗效欠佳,长期应用存在较大的副反应,制定替代或补充治疗策略至关重要。氨基酰tRNA合成酶相关作用多功能蛋白质1(aminoacyl-tRNA syn-thetase-interacting multi-functional protein 1,AIMP1)是一种具有抗血管生成特性的新型促炎因子。大量研究显示AIMP1作为多功能分泌蛋白参与多种免疫细胞的激活、促炎因子的释放以及神经元死亡。同时AIMP1作为肿瘤抑制因子,可通过靶向内皮细胞(Endothelial cells,EC)及紧密连接(tight junction,TJ)蛋白增加BBB、血肿瘤屏障通透性。miRNA作为研究最广泛的非编码RNA之一,已成为炎症诱导的构成BBB 的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC-s)基因表达变化的主要调节因子。它执行功能的主要途径是通过与靶基因在3’非翻译区(3’UTR)的信使RNA(messengerRNA,mRNA)互补结合来诱导mRNA降解或翻译抑制进而抑制蛋白质表达。研究发现属于let-7家族的miRNA在炎症期间显著下调,而过表达let-7减少了活化的内皮细胞中促炎因子的分泌和粘附分子的表达,并减弱了单核细胞在BBB上的粘附/迁移,改善了 BBB功能障碍。基于上述文献背景,我们发现3个尚未解决的问题:1)AIMP1作为新型促炎因子,在多种自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等)外周血中明显升高,且阻断AIMP1具有潜在治疗价值。然而,至今为止,AIMP1在NMOSD患者外周血的表达情况尚无相关报道;2)BBB破坏与NMOSD发病机制密切相关,修复BBB可预防NMOSD发作。研究显示NMOSD血清可增加体外BBB通透性,而NMOSD中BBB破坏的具体分子机制尚不明确,具有抗血管生成特性的AIMP1在NMOSD体外BBB通透性调节中的作用,有待于进一步探索;3)研究显示,miRlet-7f-5p具有抗炎、调节BBB功能,我们通过starbase软件分析发现AIMP1的3’UTR区与miRlet-7f-5p之间存在靶向结合位点。然而miRlet-7f-5p在NMOSD患者血浆诱导的脑内皮细胞中的表达变化以及与AIMP1之间是否存在靶向调控关系,目前尚不清楚。因此,针对上述问题并结合相关文献背景,我们做出了 3个假设:1)分泌型AIMP1蛋白可能在NMOSD患者外周血中升高,并对NMOSD临床严重程度有一定预测价值;2)NMOSD外周循环因子可能会通过增加脑微血管内皮细胞中AIMP1的表达参与体外BBB通透性调节;3)脑内皮miRlet-7f-5p可以靶向AIMP1的3’UTR区抑制AIMP1蛋白的生成,进而改善BBB功能障碍。我们的研究旨在为NMOSD中BBB破坏的分子机制探寻新的治疗靶点,以保护BBB完整性并加速恢复受损的BBB,为NMOSD提供新的诊疗思路。第一部分 分泌型AIMP1蛋白与视神经脊髓炎谱系疾病临床相关性分析目的:探究AQP4-IgG 阳性NMOSD患者血浆AIMP1水平及其对疾病严重程度的临床预测价值。方法:1.选取符合入选标准的AQP4-IgG 阳性NMOSD患者和年龄、性别相匹配的同期健康对照(HCs)作为研究对象。2.收集所有研究对象一般临床资料及实验室、影像数据,NMOSD患者的残疾程度根据EDSS评分进行判定。同时抽取2-3ml外周静脉血,离心(3000rpm/min,10-15min),分离上层血浆,分装,-80℃冻存。3.研究对象外周血中AIMP1的蛋白水平用ELISA检测试剂盒测定,并与AQP4-IgG 阳性NMOSD患者临床资料进行统计学分析。结果:1.所有NMOSD患者血浆AIMP1水平明显高于HCs,P<0.001。2.急性AQP4-IgG 阳性NMOSD患者中IVMP治疗前组血浆AIMP1水平明显高于IVMP治疗后组,P<0.001。3.急性期AQP4-IgG 阳性NMOSD患者中血浆AIMP1水平较缓解期显著升高,P=0.021。4.在急性AQP4-IgG 阳性NMOSD患者中,血浆AIMP1水平在EDSS≥4分组明显高于EDSS<4分组,P=0.001。5.急性AQP4-IgG 阳性NMOSD患者血浆AIMP1水平与EDSS评分呈正相关(r=0.485,P<0.001),与血液中补体C3浓度呈负相关(r=-0.452,P=0.001)。6.ROC分析结果显示,49.55pg/ml为预测中-重度AQP4-IgG 阳性NMOSD 患者的最佳界值浓度(AUROC 0.790,95%CI 0.653-0.926,P=0.0006)。7.单因素和多因素逻辑回归分析显示血浆AIMP1≥49.55 pg/ml(OR 0.032,95%CI 0.001-0.687,P=0.028)是中重度 AQP4-IgG 阳性 NMOSD的独立预测因子。结论:血浆AIMP1蛋白水平在急性AQP4-IgG 阳性NMOSD中明显升高,并与NMOSD的严重程度呈正相关,且对中重度NMOSD患者有一定预测价值。IVMP治疗可显著降低AIMP1的水平。上述结果表明AIMP1可能参与NMOSD疾病发病过程,可作为预测NMOSD患者的疾病严重程度或治疗效果的动态监测指标,其具体分子机制有待进一步研究。第三部分沉默AIMP1可以通过增加紧密连接相关蛋白ZO1的表达改善视神经脊髓炎谱系疾病血脑屏障功能障碍目的:本研究旨在探讨AIMP1是否参与视神经脊髓炎谱系疾病体外血脑屏障通透性调节及其具体分子机制研究。方法:1.研究对象为急性期未接受IVMP治疗的AQP4-IgG 阳性NMOSD患者和年龄、性别匹配的HCs各7例,抽取外周血,离心,分离出血浆,-80℃冻存,用于后续干预细胞实验。2.建立基于单层hCMEC/D3细胞的体外BBB模型,通过4h液面渗漏试验评价BBB模型完整性。3.实验分为Control组、Normal组及NMOSD组。分别用20%胎牛血清、10%HCs血浆+10%胎牛血清、10%NMOSD血浆+10%胎牛血清干预体外BBB模型及hCMEC/D3细胞系。4.CCK8检测hCMEC/D3细胞活力,荧光素钠(Na-F)渗透系数评估体外BBB通透性,透射电镜观察紧密连接微观结构。5.qPCR 检测血浆干预 24 后 hCMEC/D3 细胞 ZO-1、AIMP1 mRNA的表达变化;Western blot检测血浆干预48h后hCMEC/D3细胞中ZO-1、AIMP1蛋白的表达变化;6.免疫荧光检测血浆干预48h后hCMEC/D3细胞中ZO-1蛋白的表达变化及分布。7.siRNA AIMP1质粒转染hCMEC/D3细胞:1)转染效率评价:实验分为Conthttps://www.selleck.cn/products/elexacaftor.htmlrol组、siRNA-NC组及siRNA-AIMP1组,倒置荧光显微镜下观察携带CY3荧光的质粒转染情况,qPCR及Western blot测定转染24h后AIMP1 mRNA及48h后AIMP1蛋白表达情况。2)沉默AIMP1基因对NMOSD血浆诱导的hCMEC/D3细胞中ZO1蛋白的影响:随机选3例急性AQP4-IgG 阳性NMOSD患者血浆进行干预实验,实验分为NMOSD组、NMOSD+siRNA-NC 组及 NMOSD+siRNA-AIMP1 组。通过 Western blot检测hCMEC/D3细胞中各组ZO-1蛋白的变化,并计算各组Na-F渗透系数。结果:1.CCK8测定结果显示NMOSD组hCMEC/D3细胞活力较Normal组下降,P=0.006。2.与Normal组比较,NMOSD组Na-F渗透系数明显升高,P=0.001,而Normal组与Control组无明显差异,P=0.688。3.透射电镜显示Control组和Normal组紧密连接呈线状,致密,无明显松动;NMOSD组紧密连接线状结构松动且不连续。4.ZO-1表达情况:NMOSD组中ZO-1 mRNA表达较Normal组明显下调(P=0.003),Normal组与Control组比较无明显差异(P=0.178);NMOSD组ZO-1蛋白较Normal组明显减少(P<0.001),而Normal组与Control组比较ZO-1蛋白含量差异无统计学意义(P=0.695);NMOSD组ZO1免疫荧光强度较Control组及Normal组明显减弱。5.AIMP1表达情况:NMOSD血浆诱导的hCMEC/D3细胞中AIMP1 mRNA较Normal组明显上调(P=0.001),而Control组与Normal组无明显统计学差异(P=0.443);NMOSD组AIMP1蛋白含量较Normal组明显升高(P<0.001),Normal组与Control组比较无明显统计学差异(P=0.740)。6.siRNA-AIMP1质粒转染内皮细胞转染效率达90%以上,siRNA-AIMP1 组 AIMP1 mRNA(P=0.012)及蛋白表达量(P=0.004)均较 siRNA-NC组显著降低。7.NMOSD+siRNA-AIMP1组ZO-1蛋白表达量较NMOSD组升高,P=0.011;NMOSD+siRNA-NC组与NMOSD组比较,ZO-1蛋白表达量无明显差异,P=0.447;同时NMOSD+siRNA-AIMP1组Na-F渗透系数较NMOSD组降低,P=0.018。NMOSD+siRNA-NC组Na-F渗透系数与NMOSD组无统计学差异,P=0.400。结论:NMOSD患者血浆可以通过降低hCMEC/D3细胞的活力、破坏紧密连接微观结构及降低紧密连接相关蛋白ZO1的表达以增加体外BBB通透性,其血浆诱导的hCMEC/D3细胞中AIMP1 mRNA及蛋白表达显著上调,沉默AIMP1可通过增加紧密连接相关蛋白ZO1的表达在一定程度上改善NMOSD患者血浆诱导的体外BBB通透性。第三部分 AIMP1在人脑微血管内皮细胞中受miRlet-7f-5p负调控目的:本研究旨在探索miRlet-7f-5p在NMOSD患者血浆诱导的hCM-EC/D3细胞中的表达变化以及是否能靶向结合AIMP1 mRNA的3'UTR区抑制其蛋白合成。方法:1.qPCR测定NMOSD患者血浆诱导的hCMEC/D3细胞中miRlet-7f-5p表达变化:干预内皮用的血浆来自7例未接受IVMP治疗的AQP4阳性NMOSD急性期患者以及7例年龄、性别相匹配的HCs。实验分为Control组、Normal组及NMOSD组,分别用20%胎牛血清、10%HCs血浆+10%胎牛血清、10%NMOSD血浆+10%胎牛血清干预hCMEC/D3细胞系。干预24h后qPCR检测hCMEC/D3细胞中miRlet-7f-5p的表达量。2.双荧光素酶报告基因检测(靶基因验证)实验:构建miRlet-7f-5p对应AIMP1 3'UTR靶向结合位点的野生型(wt)及突变型(mut)质粒载体:即 pmirGLO-AIMP1-wt、pmirGLO-AIMP1-mut。野生型及突变型质粒载体与miRlet-7f-5p质粒、萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶共同转染239T细胞,然后测定荧光素酶活性。细胞分组如下:1)mimics NC+pmirGLO-AIMP1-wt2)miRlet-7f-5p mimics+pmirGLO-AIMP1-wt3)inhibitor NC+pmirGLO-AIMP1-wt4)miR-let-7f-5p inhibitor+pmirGLO-AIMP1-wt5)selleckchem Y-27632mimics NC+pmirGLO-AIMP1-mut6)miRlet-7f-5p mimics+pmirGLO-AIMP1-mut7)inhibitor NC+pmirGLO-AIMP1-mut8)miRlet-7f-5p inhibitor+pmirGLO-AIMP1-mut3.miRlet-7f-5p质粒转染hCMEC/D3细胞:1)质粒转染效率评价:实验分为 Control 组、mimics-NC、mimics 组、inhibitor-NC、inhibitor 组,荧光显微镜下观察转染效率,qPCR测定miRlet-7f-5p表达量。2)观察miRlet-7f-5p 对 AIMP1 蛋白的影响:实验分为 mimics-NC、mimics 组、inhibitor NC、inhibitor 组,Western blot 测定质粒转染后 hCMEC/D3 细胞中 AIMP1蛋白表达量。结果:1.NMOSD 组 miRlet-7f-5p 表达低于 Control 组(P=0.017)及 Normaglioblastoma biomarkersl组(P=0.013),Control组与Normal组miRlet-7f-5p表达无明显统计学意义(P=0.210)。2.双荧光素酶报告基因检测实验结果显示:与mimics NC+pmir-GLO-AIMP1-wt 组比较,miRlet-7f-5p mimics+pmirGLO-AIMP1-wt 的相对荧光素酶活性下降 41%(P=0.001),miRlet-7f-5p inhibitor+pmirGLO-AIM-P1-wt相对荧光素酶活性较inhibitor NC+pmirGLO-AIMP1-wt组升高35%(P<0.001),但是 mimics NC+pmirGLO-AIMP1-mut 组与 miRlet-7f-5p mimics+pmirGLO-AIMP1-mut组之间相对荧光素酶活性无明显差异(P=0.673),同样 inhibitor NC+pmirGLO-AIMP1-mut 组与 miR1et-7f-5p inhi-bitor+pmirGLO-AIMP1-mut组之间无统计学差异(P=0.525)。3.miRlet-7f-5p质粒可高效转染hCMEC/D3细胞。倒置荧光显微镜下(4×)视野中CY3荧光标记的miRlet-7f-5p质粒转染效率可达85%左右。qPCR结果显示:miRlet-7f-5pmimics组中miRlet-7f-5p的表达量较Control组、miRlet-7f-5p mimics-NC组明显升高,高达约 350 倍,P=0.019。inhibitor 组中 miRlet-7f-5p 的表达量较 Control 组、mimics-NC 组明显降低,为 Control 组的 0.093 倍,P<0.001。而 miRlet-7f-5p的表达量在Control组、mimics NC组和inhibitor NC组之间无明显差异,P>0.05。4.miRlet-7f-5p mimics 组中 AIMP1 蛋白表达量较 mimics-NC 组明显降低,P=0.024,而 miRlet-7f-5p inhibitor 组 AIMP1 蛋白表达量较 inhibitor NC组之间无明显差异,P=0.541。结论:miRlet-7f-5p在NMOSD患者血浆诱导的hCMEC/D3细胞中表达降低,在hCMEC/D3细胞中miRlet-7f-5p通过特异性结合AIMP1的3’UTR区,抑制AIMP1蛋白的合成。