目的:本研究旨在通过蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学联合分析,探索子宫内膜异位症发病机制相关的特异性蛋白和磷酸化位点,验证其对子宫内膜异位症发病机制的影响,以期对子宫内膜异位症的早期诊断及非激素治疗靶点研究提供理论依据。方法:1)本研究选择卵巢子宫内膜内异症患者为研究对象,取患者异位子宫内膜、在位子宫内膜组织样本各5例,再选取健康女性正常子宫内膜组织样本5例为对照组,提取总蛋白经蛋白酶解后,LC-MS/MS高分辨质谱分析,TMT标记,肽段分级,高分辨质谱仪检测差异表达蛋白,得到原始数据。再用TMT标记磷酸化肽段,串联使用Ti O2法和IMAC法富集磷酸化肽段,高分辨质谱仪检测获得质谱原始数据,生物信息学分析得出差异表达蛋白及差异蛋白磷酸化修饰位点。2)从全局角度观察蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据特征,两组学联合分析研究,采用去本底分析、PCA分析、Venn及火山图等统计学方法联合分析两组学中差异蛋白肽段、差异磷酸化修饰肽段组间、组内的差异性,采用柱状图和圈图分析GO、KEGG的注释和富集功能差异,采用motif分析、激酶-底物预测、激酶-底物相互作用PPI互作网络分析挖掘差异最显著的激酶及底物,采用KSEA分析来预测激酶活性,结合KEGG通路分析结果,寻找到更重要、更具研究价值的蛋白激酶、磷酸化事件和关键信号通路。然后选择一具有研究价值的信号通路、选择此信号通路中相关的活性差异最大的蛋白激酶及底物,应用q RT-PCR方法进行差异性验证。3)基于两组学研究得出的具有研究价值的PI3K/AKT信号通路及Axl、mTOR蛋白激酶靶点进行验证及功能研究,研究对象同前,分离培养HEc ESCs、HEu ESCs及HEn ESCs并免疫组化鉴定,研究在细胞水平靶向上游Axl激酶、mTOR激酶调控PI3K/AKT信号通路影响HESCs细胞凋亡的机制。采用q RT-PCR验证HEc ESCs、HEu ESCs及HEn ESCs、Axl、mTOR、p-mTOR及其m RNA的表达差异;细胞水平选择si RNA转染调控Axl靶点、雷帕霉素调控mTOR靶点,采用WB、q RT-PCR检测Axl、mTOR、p-mTOREnasidenib研究购买 cyclin D1表达差异。结果:1)三组样本的蛋白质组学研究共筛选到7575个差异蛋白,异位子宫内膜组与在位子宫内膜组比较差异蛋白数量最多共535个,其中上调272个,下调263个;其次是异位子宫内膜组与正常子宫内膜组比较差异蛋白296个,其中上调198个,下调98个;在位子宫内膜组与正常子宫内膜组比较差异蛋白52个,其中上调12个,下调40个。GO注释及富集分析结果在生物过程方面异位子宫内膜组与正常子宫内膜组比较细胞外基质组织,生长板软骨软骨细胞形态发生和弹性纤维组装等差异最显著。在分子功能方面在位子宫内膜组与正常子宫内膜组比较抗原结合,CXCR3趋化因子受体结合和白细胞介素-8受体结合等差异最显著。在细胞组份方面三组样本具有差异的是细胞外空间,在位子宫内膜组与正常子宫内膜组比较免疫球蛋白复合物和血红蛋白复合物差异显著,异位子宫内膜组与在位子宫内膜组和正常内膜组分别比较含胶原细胞外基质、Z盘和膜攻击复合体等功能差异显著。KEGG注释及富集分析结果三组间差异排名前几位的通路分别为代谢通路、PI3K/AKT信号通路、补体和凝血级联、粘着斑、癌症通路及系统性红斑狼疮等。三组间共同的差异信号通路是代谢通路、PI3K/AKT信号通路。异位子宫内膜组与在位子宫内膜组和正常子宫内膜两组间比较差异蛋白亚细胞定位分布按占比大小排序,依次为细胞核、细胞外、质膜和细胞质。在位子宫内膜组与正常子宫内膜组比较差异蛋白亚细胞定位分布按占比大小排序,依次为细胞外、细胞核、细胞质和质膜。2)在蛋白质组学研究基础上联合磷酸化蛋白质组学研究,分析结果显示蛋白质组学和磷酸Angiogenesis抑制剂化蛋白质组学共有的蛋白质有2071个,蛋白质组学特有的蛋白质有5504个,磷酸化蛋白质组学特有的蛋白质有53个。异位子宫内膜组与正常子宫内膜组比较差异磷酸化蛋白数量最多共1701个,其中上调607个,下调1094个。异位子宫内膜组、在位子宫内膜组与正常子宫内膜组三组共有的差异磷酸化蛋白为丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白2。异位子宫内膜组、正常子宫内膜组分别与在位子宫内膜组比较共有的差异磷酸化归属蛋白为延伸蛋白A。异位子宫内膜组与在位子宫内膜组和正常子宫内膜分别比较共有的差异磷酸化蛋白为激酶A锚定蛋RIPA Radioimmunoprecipitation assay白12和山梨糖SH3结构域蛋白2。三组间差异磷酸化蛋白KEGG富集分析结果主要的差异信号通路在核质运输、粘着斑、嗅觉传导、剪接体、黑素原生成、长时程增强、血管平滑肌收缩、甲状腺激素、肝细胞肝癌和肿瘤小分子RNA等信号通路。三组间差异蛋白亚细胞定位分析结果异位子宫内膜组与正常子宫内膜组比较质膜的差异蛋白质及差异磷酸化蛋白的差异最显著,异位子宫内膜组与正常子宫内膜组间比较差异磷酸化蛋白差异枢纽蛋白有两个,为肌球蛋白轻链激酶和平滑肌和肌球蛋白-11,可能与子宫内膜异位症迁移、种植、侵袭可能有关。激酶-底物预测分析比较三组间差异底物数量排列前10的激酶,三组比较结果中共有的激酶是PRKACA、MAPK3、CDK1、CSNK2A1、CDK2、MAPK1、AKT、AKT1、PRKACA、PRKACD,其中MAPK、AKT激酶均参与mTOR信号通路。KSEA分析三组激酶活性差异,异位子宫内膜组与正常子宫内膜组间比较结果,差异最显著且活性上调的激酶有AKT1、AKT、MAPKAPK2、MAPK12等,差异最显著且活性下调的激酶有CDK2、CDK1、CDK7与MTOR等,活性上下调的共有激酶是AKT、MAPK、MTOR,均与PI3K/AKT信号通路有交互联系,Axl激酶为P13K/AKT信号通路上游重要的调控点,选择PI3K/AKT信号通路、MTOR激酶及Axl激酶为下一步的研究靶点验证并开展功能性研究。3)q RT-PCR检测结果对比分析正常子宫内膜间质细胞,在位及异位子宫内膜间质细胞中Axl及mTOR m RNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组比较,雷帕霉素组及Axl-si RNA组Axl、cyclin D1 m RNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05);与雷帕霉素组相比,在Axl-si RNA组中Axl m RNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05);对比分析阴性对照组数据,雷帕霉素组Axl、cyclin D1 m RNA等表达水平差异有统计学意义(P<0.05);与阴性对照组数据相比,Axl-si RNA组中Axl和cyclin D1 m RNA的表达差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组比较,雷帕霉素组中mTOR m RNA相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组、雷帕霉素组、阴性对照组比较分析,Axl-si RNA组数据差异显著有统计学意义(P<0.05);四组间mTOR蛋白表达未见显著差异;与空白对照组相比较,雷帕霉素组及Axl-si RNA组中p-mTOR、cyclin D1蛋白表达差异显著有统计学意义(P<0.05),与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:基于LC-MS/MS高分辨质谱,TMT蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学两组学的联合分析子宫内膜异位症临床样本研究,成功筛选出了子宫内膜异位症发病机制相关的具有研究价值的一系列的差异蛋白、信号通路及最具活性的激酶及底物。其中的PI3K/AKT信号通路,mTOR激酶以及上游Axl激酶验证,Axl和mTOR激酶在异位内膜间质细胞,在位子宫内膜中均高表达,验证了组学差异,证实Axl、mTOR参与了子宫内膜异位症的发生。Axl通过介导PI3K/Akt信号通路参与了异位子宫内膜间质细胞的活化与增殖,mTOR可能通过PI3K/AKT信号通路以外的其他机制与Axl参与子宫内膜异位症的发生。调控Axl、mTOR激酶,可促进子宫内膜间质细胞凋亡,Axl、mTOR可成为子宫内膜异位症发病机制及非激素靶点药物的研究思路之一,需开展更深入的体内研究验证。深挖组学分析结果可筛选出更多具有研究价值的靶点,为探索子宫内膜异位症早期筛查、诊断及非激素靶点药物研究提供更多的思路。